H7N9禽流感病毒小鼠感染动物模型构建技术原理

　　材料与方法

　　1、材料

　　1.1 实验动物

　　SPF 级雌性BALB /c 小鼠70 只，体重13 ～ 15 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK( 京) 2012-0001】提供。动物实验在中国医学科学院医学实验动物研究所生物安全三级实验室中【卫ABSL3-021】进行。并通过了中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物伦理委员会的审查，批准号【ILAS-PS-2013-006】。

　　1.2毒株

　　A/Anhui /1 /2013 ( H7N9) 禽流感病毒由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所提供。

　　1.3仪器和试剂

　　血常规检测仪器: Beckman ACT TM Coulter，USA。麻醉用盐酸氯胺酮，沈阳兽药厂，批号

　　20130325; 免疫组化试剂: 甲型流感病毒NP 蛋白小鼠单抗， IＲＲ 公司，货号FＲ-51。二抗及DAB 显色剂为北京中杉金桥产品，货号PV-9001，ZLI-0001。

　　2 、方法

　　2. 1 动物分组

　　小鼠按照体重随机分为生理盐水对照组、高、中、低感染剂量组，每组10 只，分别接种1 × 108，1× 107 或1 × 106 TCID50的病毒用于观察临床症状和死亡率。另外30 只小鼠接种1 × 106 TCID50的病毒，分别于攻毒后1、2、3、5、7 d 随机挑选6 只安乐死，用于病毒载量检测和组织病理学观察。

　　2. 2 攻毒

　　小鼠用浓度为20 mg /mL 的盐酸氯胺酮注射液肌肉注射麻醉，麻醉剂量每只小鼠0. 1 mL。将50μL 1 × 108、1 × 107 或1 × 106 TCID50的H7N9 禽流感病毒原液用移液器滴入小鼠鼻腔; 对照组小鼠滴入50 μL 生理盐水。接毒后的小鼠正常饲养，供给饲

　　料量为标准日粮，饮水用高压灭菌水，足量供给。

　　2. 3 观察指标

　　攻毒开始前的时刻记为0 天，攻毒后14 d 内每隔24 h 观察一次，包括小鼠的活动、反应性、饮食、呼吸及有无弓背、竖毛、蜷缩、颤抖和死亡等。每天用电子秤测量体重。

　　2. 4 病理检查

　　攻毒后1、2、3、5、7 d 随机挑选3 只小鼠安乐死，取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠用于病理标本制备，病理标本制备方法采用甲醛固定，石蜡包埋、切片，H． E 和免疫组化染色。免疫组化染色采用SP 法:一抗稀释度1∶ 200，4℃过夜，PBS 洗; 加二抗，室温孵育10 min，PBS 洗; DAB 显色，苏木素衬染后脱水、透明、中性树胶封片。

　　2. 5 病毒载量和抗体测定

　　攻毒后1、2、3、5、7 d 随机挑选3 只小鼠安乐死，用生理盐水对肺组织进行灌洗，取肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 和肺、心、肝、脾、肾、脑、肠等组织接种到MDCK 细胞，观察细胞病变。攻毒后第14 天摘取眼球取血，离心取上清，用血凝抑制法( hemagglutination inhibition test，HI)进行抗体滴度测试［3］。

　　2. 6 白细胞计数

　　感染后1、2、3、5、7 d 摘取小鼠眼球取抗凝血进行白细胞总数和分类计数。

　　2. 7 统计学方法

　　数据以( 珋x ± s) 表示，数据应用SPSS 13. 0 软件包进行统计处理数据。组间比较采用方差分析的两两q 检验; 率的比较采用卡方检验。以P ＜ 0. 05 和P ＜ 0. 01 表示有统计意义。