同类细胞分泌的外泌体具有各种不同形态 | 你电镜打出来的外泌体长啥样?

细胞外囊泡(EVs)由所有已知生物体产生并且对细胞通信和生理学很重要。已经发现血浆、母乳和精液等体液中EVs的形态多样性。然而,从单细胞类型纯化时,尚未对外泌体进行详细的形态学分析。

来自瑞典哥本哈根大学的Jan Lötvall和Johanna L Höög在最新的Journal of Extracellular Vesicles杂志发表文章,通过多种电子显微镜技术分析和定量从人类肥大细胞系HMC-1纯化的外泌体的形态。结果显示外泌体形态的多样性,表明可能存在具有不同和特异功能的外泌体亚群。该研究结果意味着需要一种新的更有效的定义外泌体亚群的方法。研究人员提出了一种分类系统,根据其体型和形状将外泌体分为9个不同的类别。除形状外,在外泌体中也发现了三种其他的形态学特征。

这些研究结果表明,从单个细胞系纯化的外泌体也具有形态多样性,与以前对体液中EVs的观察结果相似。这些知识可以帮助改善实验结果的解释,扩大我们对外泌体生物学功能的常规理解。

细胞多泡小体(MVB)内的膜泡具有形态多样性

为了研究HMC-1细胞系产生的外泌体的形态特征,采用多种电子显微技术。如材料与方法部分所述,HMC-1细胞在高压冷冻、冷冻置换和切片后成像。结果显示,细胞内有多个MVB。MVB含有结构不同的囊泡以及正常的单囊泡。一些MVB包含不同大小的囊泡或填充更多的电子致密成分,或含有高电子密度的结构。

图1.显示培养的HMC-1细胞的多泡体(MVB)和周围生长培养基中细胞外囊泡的切面。(A)白框内是HMC-1细胞内的MVB,黑框内是细胞外囊泡(EV)。黑色箭头指示的是细胞突起。(B–H)更高放大倍数的MVBs。白色箭头指向含有一个或多个较小囊泡的囊泡。纯箭头指向分泌颗粒中的电子密度结构。(I-L)更高放大倍数的EV。

这些研究结果表明,即使在释放到环境中之前,细胞培养基中EV和MVB内囊泡的形态学存在多样性。因此,我们会检测到经典分离程序后外泌体的形态多样性。

HMC-1细胞来的外泌体可被分为9个类别

使用差速超速离心分离外泌体,然后用密度梯度纯化分离的外泌体。使用两种不同的技术对外泌体进行成像:负染和冷冻电镜(cryo-EM)。用负染观察到形状和大小的差异,观察到长的小管样囊泡被许多其他不同直径的圆形囊泡包围。由于冷冻电镜可以观测脂质双层和囊泡内部结构,所以可以检测囊泡结构、膜和腔等多种信息。

图2.从HMC-1纯化的形态多样的外泌体。 (A) Exosomes visualised after negative staining. (A)负染后的外泌体。在这张照片中可以确定至少两种不同类别的囊泡:单囊泡(绿色箭头)和长小管(红色箭头)。(B)九个冷冻电子显微照片的拼图。绿色箭头指向单个囊泡,黄色箭头指向双囊泡,小黑色箭头指向基准金标记。圆形形状是多孔碳网格的碳边缘。(C)所有囊泡的大小分布(n =1724)。括号中的数字表示多少囊泡大于500 nm。(D)每个形态类别的囊泡总数百分比。(E)每个囊泡类别的尺寸分布。

1.单囊泡(Single vesicle)(n = 1409)

单囊泡是所有统计外泌体的大部分(81.7%)。它们被膜双层包被,圆形。 它们的大小范围为71±58 nm(平均值±SD)。

2.双囊泡(Double vesicle) (n = 19)

双囊泡是一个较大的囊泡包含一个较小的囊泡,形状为圆形或稍微细长。它们的尺寸大于平均单囊泡(174±101 nm; t检验,p <0.001)。

3.多膜泡(Triple vesicle or more) (n = 4)

当两个或更多个囊泡被包含在较大的囊泡内时,被分为这一类。它们有不同的组合,具有彼此相同的三个囊泡,或者在同一个大囊泡内部具有两个较小的囊泡。只有四个囊泡被归为该类,最小的65 nm,最大的380 nm。

4.小双层膜泡(Small double vesicle) (n = 19)

这些囊泡与常规双囊泡不同,因为内部结构比双层薄且不连续,这意味着它们的形状没有形成一个完整的圆形。 它们也显著小于双囊泡,其尺寸范围为54±10nm(t检验,p <0.001)。

5.椭圆膜泡(Oval vesicle) (n = 151)

椭圆形囊泡具有一个双层膜,类似于单个囊泡,但它们呈细长形状,仅具有两个垂直的对称轴。它们的平均大小为114±86nm。

6.小管(Small tubule) (n = 50)

这些囊泡的特征为单层和细长的形状,但它们与椭圆形囊泡不同,沿其细长轴,其对称轴线的相对侧上的膜彼此平行,导致这些囊泡具有更多的管状形状。它们的尺寸平均为145±87 nm。

7.大管(Large tubule) (n = 4)

大管不同于小管,因为它们的大小(废话,囧…)。仅鉴定出四个大管,并且它们都长于700 nm;最长的是1400 nm。

8.不完整的膜泡(Incomplete vesicle) (n = 15)

这些囊泡显示中断的膜,并且通常被电子致密的成分包围。可能是在样品制备过程中发生破裂。

9.不规则膜泡(Pleomorphic vesicle) (n = 53)

所有不能归类于上面任何类别的囊泡形状都被称为不规则型。 它们的尺寸大于单囊泡(201±87 nm; t检验,p <0.001)。

除了所有这些类别之外,还观察到由位于几个单、双和三圆囊泡旁边的断膜组成的复杂结构。

在不同类别的囊泡中可以发现三个附加特征

除了它们的形态特征之外,一些囊泡具有独立于它们所属类别的三个特征。每个特征的示例如图5(A-I)所示。

图5.外泌体特征列举(A-I)。表面具涂层的膜泡(coated vesicles)(A-D)、内含纤维的膜泡(filamentous vesicles)(D-F,I)和电子致密囊泡(electron-dense vesicles)(D,G-I)的实例。 浅蓝色箭头指向涂层,棕色箭头指向纤维,灰色箭头指向囊泡内的电子致密区域。(J)呈现每个特征的每个囊泡类别的百分比。(K)具有特征的囊泡尺寸分布。

1. 表面具涂层的膜泡(Coated vesicles)

一些囊泡具有表面突起,从膜突出的电子致密尖峰或膜的一部分。大约3.7%的囊泡显示了这个特征(1724年中有63个),平均大小为221±133 nm。

2. 内含纤维的膜泡(filamentous vesicles)

观察到囊泡的一小部分(0.5%)在其内腔中含有纤维。在具有管状形状的囊泡中,细丝与小管的长度平行排列,但是在圆形囊泡中,细丝可以彼此平行排列或更随机分布。内含纤维的囊泡的大小是非常可变的,因为在单个囊泡以及小和大的管中均发现纤维。四个大管中有两个是具有纤维的。

3. 电子致密囊泡(electron-dense vesicles)

这些囊泡似乎充满了电子致密的成分,与相同尺寸的附近囊泡相比,它们的管腔中的纹理更暗。它们的平均大小(306±141 nm)高于总囊泡计数的平均值(t检验,p <0.001)。

特征不是相互排斥的,因为在一些情况下,囊泡可以呈现多于单一特征。

参考文献:

Zabeo D, Cvjetkovic A, Lässer C, et al. Exosomes purified from a single cell type have diverse morphology[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2017, 6(1): 1329476.

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