实时荧光定量PCR技术实验操作流程

1.RNA提取：

　　针对茎环状结构RT引物，RNA正常提取就好;对于Oligod(T)特异的RT引物，尽量用特殊试剂盒提取miRNA。

　　2.反转录：

　　反转录过程对酶没有特殊要求，操作按照反转录酶的说明书进行。对于引物，在反转录过程中只需加入Oligod(T)特异的RT引物或茎环状结构RT引物，不需要另外添加其他RT引物。用Oligod(T)特异的RT引物时，RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。

　　内参基因不需要单独设计RT引物，可以用荧光定量PCR的反向引物作为RT引物。

　　3.荧光定量PCR：

　　先优化PCR体系(引物浓度、退火温度等)，进行引物测试，确保扩增曲线正常且溶解曲线为单一的尖峰，阴性对照无扩增，则引物测试合格，再进行后续实验(常规操作)。