林兰教授治疗甲亢经验及甲亢宁胶囊调控FRTL-5细胞ERK通路的机制研究

甲状腺机能亢进症(以下简称甲亢)是当前最常见的甲状腺疾病之一。口前该病的发病机制尚不明确,尚缺乏针对性的治疗药物,常规抗甲状腺药物无法解决甲状腺细胞过度增殖和甲亢复发问题。林兰教授从医50余载,对甲亢的治疗等方面认识深刻,研发了许多有效的治疗方剂,中药甲亢宁胶囊(以下简称“甲亢宁)即是其防治甲亢的临床经验的精髓之一。本论文首先对导师林兰教授治疗甲亢的经验进行了系统的整理,然后以体外培养的FRTL-5甲状腺细胞作为研究对象,从干扰和过表达两个方面,探讨甲亢宁通过调控ERK信号通路,抑制甲状腺细胞增殖、促其凋亡从而调节甲状腺细胞生长的可能分子机制。

1临床研究目的：基于导师林兰教授治疗甲亢的临床资料,通过数据分析,总结其治疗甲亢的方药运用规律。结合与导师交流,人机结合,以人为主,总结其治疗甲亢肝损害、甲亢合并白细胞减少症、甲亢合并突眼、甲亢伴月经病等的临床经验。为总结和提炼甲亢中医药防治规律提供循证依据。方法：将2013年12月-2015年12月林兰教授在广安门医院内分泌门诊确诊的160例甲亢患者的437诊次的病例录入EXCEL2007表格。利用SPSS19.0软件、weka3.7数据挖掘软件、Liquorice数据挖掘软件,运用频数分析、聚类分析、关联规则、复杂网络等方法分析林兰教授处方用药规律。通过与导师交流,整理导师治疗甲亢、甲亢合并肝损害、甲亢合并白细胞减少症、甲亢合并突眼、甲亢伴月经病等的临床经验。结果：(1)筛选出符合标准的甲亢病例160例,得到治疗本病所涉及的中药167味,使用总频次为9032次,其中频数在10次以上的药物共有64味,总频数为8634次。

其中生龙骨、煅磁石、珍珠母、麦冬、酸枣仁、五味子、夏枯草、法半夏、山慈菇等是林老治疗甲亢的核心药物。

(2)将林教授437诊次治疗甲亢的处方中所有中药按照药物出现的总频次进行排序,频次超过10次的作为高频中药。参考第七版《中药学》教材及《中华本草》,将69味高频中药按照功效进行分类,并将各类中药中的所有药物使用频次加和并排序。统计结果显示

,林兰教授治疗甲亢使用最多的是补虚药、安神药,其次为清热药、活血化瘀药、平肝息风药等。在补虚类药物使用上,以用补血药和补阴药为主,补气药和补阳药为次。林教授治疗甲亢常用具有滋阴潜阳、安神功效的中药。

(3)采用SPSS19.0软件对高频中药进行聚类分析,结果显示林兰教授的治疗甲亢的处方分为九类：

益母草、丹皮、山萸肉、紫河车、当归；盐杜仲、泽泻、炒白术、覆盆子、益智仁、香附、黄连、木香、红花、川芎、檀香、生黄芪、制远志、决明子：菌陈、黄柏、生牡蛎、珍珠母；白芍、生龙骨、五味子、夏枯草、麦门冬、太子参、柏子仁、酸枣仁；山慈菇、牛蒡子；枸杞子、煅磁石、钩藤；郁金,元胡；半夏,枳实。

(4)采用Liquorice数据挖掘软件对高频中药进行分析,结果显示林兰教授的治疗甲亢的核心处方以滋阴潜阳、化痰散结、益气养阴功效为特点,

生龙骨、煅磁石、夏枯草、枸杞子、钩藤、太子参、麦冬、白芍、五味子、生地、熟地、柏子仁、酸枣仁是最常见的方剂组合

。(5)采用weka3.7数据挖掘软件,运用关联规则方法分析常用药对,并结合与导师交流,总结出林教授临床常使用的

药对为：

熄风潜阳组合—生龙骨、煅磁石；化痰散结组合—山慈菇、牛蒡子、浙贝母、连翘；疏肝理气组合—柴胡、白芍；理气化痰组合—半夏、枳实、郁金、元胡；益气养阴组合—太子参、麦冬、五味子；健脾燥湿组合—苍术、厚朴；安神组合—生龙骨、生牡蛎、煅磁石、珍珠母；酸枣仁、柏子仁；健脾化湿组合—茯苓、泽泻；滋补肝肾组合—覆盆子、益智仁、杜仲；养肝明目组合—枸杞子、决明子；祛风明目组合—青葙子、密蒙花。

(6)通过与导师交流,总结了导师治疗甲亢分气滞痰凝、阴虚阳亢、阴虚火旺、气阴两虚四型论治,重视化痰活血,强调配合西药治疗。

导师治疗甲亢合并突眼,强调辨主症论治。治疗甲亢合并肝损害,提倡分期论治。治疗甲亢伴白细胞减少症,以益气滋阴养血为治疗大法。治疗甲亢伴月经病,应用甲状腺药物维持治疗的同时,运用中药人工周期疗法。

结论：本课题首次利用频数分析、聚类分析、关联规则、复杂网络等数据挖掘技术,对林兰教授治疗甲亢的临床用药规律进行了分析,并结合口传心授,总结出了林兰教授对甲亢、甲亢突眼、甲亢合并肝损害、甲亢合并白细胞减少、甲亢伴月经病的处方用药规律和治疗体会。

2实验研究目的：从ERK信号传导通路探讨中药甲亢宁胶囊治疗甲亢的分子机制。方法：以原代培养的FRTL-5细胞为研究对象,采用CCK-8法筛选出甲亢宁抑制FRTL-5细胞增殖的最佳浓度,作为干预FRTL-5细胞的药物浓度。实验共设立对照组(Con)、甲亢宁组、甲亢宁+ERK1/2-siRNA组、siRNA阴性序列组(NO)、siRNA干扰组、过表达慢病毒组、甲亢宁+过表达慢病毒组、空病毒组(NC)等组别,分别采用CCK-8法检测甲亢宁对各组细胞增殖情况的影响、放免法测定各组细胞上清中的cAMP释放量、AV/PI双染法测定各组细胞凋亡率、Western Blot法以及RT-qPCR法观察ERK通路上增殖、凋亡相关基因(c-Raf、 p-ERK1/2、ERK1/2、Caspase-9、CyclinD1、Bcl-2、Bax)mRNA和蛋白表达的变化。以ERK1/2为切入点,利用RNAi技术阻断ERK信号传导通路,并应用慢病毒载体对ERK信号传导通路进行过度活化,从ERK1/2基因沉默和过表达两方面研究甲亢宁调控FRTL-5细胞ERK通路的机制。结果：(1)本实验采用原代培养出的FRTL-5细胞,冻存了足够的细胞,为后续的实验研究奠定了基础。(2)本实验采用CCK-8法检测法观察出不同甲亢宁浓度、不同干预时间的FRTL-5细胞增殖情况,经过重复实验,最终确定以5.438mg/ml的含甲亢宁的F12完全培养基干预的第24h作为FRTL-5细胞的干预浓度最为适宜。(3)采用CCK-8法证实了甲亢宁对FRTL-5细胞增殖具有抑制作用。(4)采用Annexin V/PI双染法检测了甲亢宁对转染ERK1/2-siRNA和感染ERKl/2过表达慢病毒的FRTL-5细胞凋亡的影响,结果显示,与对照组相比,甲亢宁组细胞发生凋亡(P<0.01),经ERK1/2-siRNA干扰后FRTL-5细胞发生凋亡,甲亢宁协同组细胞凋亡更加显著(P<0.05),ERK1/2-siRNA组、ERK1/ 2-siRNA阴性序列组的凋亡率与对照组相比增加但无统计学意义。与甲亢宁组相比,甲亢宁+ERK1/2-siRNA组、甲亢宁+ERK1/2慢病毒组的细胞凋亡率差异无统计学意义,其余各组的细胞凋亡率与甲亢宁组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与ERK1/2-siRNA阴性序列组相比,甲亢宁+ERK1/2-siRNA组细胞的凋亡率明显升高(P<0.01)。与空病毒组相比,甲亢宁组、甲亢宁+ERK 1/2-siRNA组的凋亡率明显升高(P<0.01)。(5)采用放免法测定各组细胞上清中的cAMP释放量,与对照组相比,ERK1/2-siRNA组、ERK1/2-siRNA阴性序列组的cAMP释放量无显著差异,其余各组的cAMP释放量与对照组相比,均有所降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其中甲亢宁组的cAMP释放量降低最为显著。与甲亢宁组相比,对照组、ERK1/2-siRNA组、ERK1/2-s iRNA阴性序列组的cAMP释放量差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(6)RT-qPCR法检测结果显示,与对照组相比,甲亢宁组、ERK1/2-siRNA组、甲亢宁+ERK1/2-siRNA组的c-Raf、ERK1、ERK2、CyclinD1、Bc1-2 mRNA表达量均显著降低(P<0.01)；甲亢宁组的BaxmRNA、Caspase-9mRNA表达量增高但无统计学意义,ERK1/2-siRNA组、甲亢宁+ERK1/2-siRNA组的BaxmRNA、Ca spase-9mRNA表达量显著增高(P<0.01)；与对照组相比,过表达慢病毒组、甲亢宁+慢病毒组的c-Raf、ERK1、ERK2、Bax的]mRNA表达量明显增高(P<0.01),CyclinD1mRNA、Bcl-2mRNA的表达量明显降低(P<0.01)。(7)Western Blot法检测结果显示,甲亢宁组、ERK1/2-siRNA组、甲亢宁协同组的c-Raf、p-ERK1/2、ERK1/2、CyclinD1、Bcl-2的蛋白表达均显著下调(P<0.01)；甲亢宁组的Caspase-9蛋白表达量增高(P<0.01),ERKl/2-siRNA组、甲亢宁协同组Bax、Caspase-9的蛋白表达显著上调(P<0.01)；与对照组相比,过表达慢病毒组、甲亢宁+慢病毒组的c-Raf、p-ERK1/2、ERK1/2、Bax的蛋白表达明显上调(P<0.01),CyclinD1mRNA、Bcl-2的蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论：ERK1/2-siRNA可以协同甲亢宁所致的抑制FRTL-5细胞增殖、促其细胞凋亡的作用；ERK1/2的过表达使FRTL-5细胞获得更高的增殖与抗凋亡能力,对甲亢宁的抗药性显著增加；甲亢宁对ERK1/2的磷酸化起阻断作用,甲亢宁通过调控ERK1/2的表达从而调节FRTL-5细胞中c-AMP、c-Raf、Bax、Bcl-2. Caspase-9 及 CyclinD1的表达,而抑制FRTL-5细胞增殖、促进其凋亡,从而改善甲状腺细胞动力学平衡,调控甲状腺细胞生长。...