Omics精进09|mRNA生信分析常规流程

本文介绍「mRNA生信分析流程」

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mRNA生信分析速览

mRNA生信分析主要包含以下各部分。

mRNA分析详细步骤

数据质控及过滤

FastQC数据质控

关注测序数据的碱基质量、GC比等，见上图红框部分内容，一般会看一下几个图如，「重点图1」

「重点图2」

更多戳：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/good_sequence_short_fastqc.html

cutadapt数据过滤

去文库构建时加入的接头、reads两端低质量碱基、含N碱基、去短的reads。

参考基因组比对

利用转录组比对软件，将上一步得到的clean reads与对应物种基因组比对。转录组「比对软件」，可选择HISAT2或STAR或TopHat（按需选择），三者差异：

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  • HISAT2比对速度是STAR的2.5倍，是TopHat的100倍；
  • 相比于STAR和TopHat，STAR允许更多的soft-clipped事件和错配，会得到更多比对reads；

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「比对的作用」：1、评估文库构建的质量（文库构建时随机打断，如果文库优质，打断随机性好，比对时会发现reads均匀分布在基因组上）；2、评估mRNA测序是否有意义（理论上reads应主要比对到CDS_Exons ，原因如下图，CDS_Exons占据mRNA绝大部分）。

转录本组装

「组装原因」，由于二代测序读长限制，必须把mRNA打断成小片段进行测序，组装的目地就是利用生信方法重新拼接全长转录本。「主流组装软件」为「Stingtie」和「Cufflinks」，两种软件差异：

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  • StringTie比Cufflinks更为准确和灵敏；
  • StringTie的速度比Cufflinks快；
  • StringTie组装的转录本的数目比Cufflinks多；

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基因表达量分析

  • 基因表达量即在当前研究条件下，一个细胞中、或者是一定摩尔量的 RNA中某个特定基因比对上了多少条转录本（绝对定量，需要知道细胞个数）或者比对上转录本的比例（相对定量），更直接一点讲就是比对上reads的count数；
  • 基因表达量与「基因长度」，「测序深度」成正相关：一个样本中，A基因越长，建库时被随机打断的片段越多，被测序的概率越大，比对到A基因的reads就越多；不同样本中，样本的测序深度越高，A基因被测到的次数越多，比对到A基因的 reads 就越多。所以，直接数reads来算表达量的方法是有问题的，有TPM/FPKM/RPKM三种标准化方法，将reads数除以基因长度，测序深度来校正二者对表达量影响。

TPM、RPKM、FPKM区别

  • TPM/FPKM/RPKM三种标准化方法差异：

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  • 「TPM」（Transcripts PerKilobase Million）

Xi，比对到基因i上的read数Li，基因i的长度（所有外显子长度的总和）Xi/Li，i基因校正后的reads数，使用基因长度校正每个基因的reads数「i基因的TPM即」，i基因长度校正后的reads数 「/」 样本所有基因长度校正后reads数之和

  • 「RPKM」（Reads Per Kilobase Million）

「i基因的RPKM即」，i基因长度校正后的reads数 「/」 样本所有基因reads数之和也就是一个样本中一个基因的RPKM等于落在这个基因上的总的read数(total exon reads)与这个样本的总read数(mapped reads (Millions))和基因长度(exon length(KB)) 的乘积的比值。

  • 「FPKM」（Fragments Per Kilobase Million）

FPKM与RPKM的区别名称中即可知，FPKM将Reads数换成了Fragments数（下图为reads和Fragments区别），对于SE测序策略，FPKM等价RPKM；对于PE测序策略，FPKM使用Fragments计算；

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表达量分析

虽然认为TPM更准确，但是由于三者可相互转换，所以都在用。根据关注点不同，可以使用不同的软件组合：

  • 关注已知和新转录本定量，可用Cufflinks或StringTie；
  • 关注转录本水平定量，可用RSEM或eXpress直接将reads比对到参考转录本；
  • 不经过比对的定量，节省计算资源，可用Sailfish或Salmon或quasi-mapping或kallisto；

基因差异表达分析

「转录组分析的重要目标」就是找case组和control组样本之间差异表达的基因；差异表达分析依赖上一步所获的各基因表达量；分析工具有很多，根据「依赖技术」可划分为：

  • count-based 方法，可用DESeq、limma和edgeR；
  • assembly-based方法，可用Cuffdiff和Ballgown；
  • alignment-free方法，sleuth；

根据「有无生物学重复」，无生物学重复可用DESeq，有生物学重复可用DESeq2；

差异基因KEGG|GO富集分析

评估差异基因主要影响的生物学功能和通路。

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）

找差异表达基因主要显著影响了哪些「生化代谢途径和信号转导途径」。

GO（GENE ONTOLOGY）

找差异表达基因主要富集在哪些GO term（分子到生物过程，分三类：molecular function、cellular component、biological process）中，评估「差异表达基因与哪些生物学功能显著相关」，对生物学功能起上调还是下调作用。

基因融合分析

两个或多个基因的CDS首尾相连，共享同一套调控序列形成新的基因，即为基因融合事件，可发生在基因组和转录组水平，如下图。

转录组和基因组层面融合差异（https://www.cnblogs.com/aipufu/p/11615336.html）

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基因融合的鉴定，可以基于全基因组测序数据（whole-genome sequencing，WGS），也可以利用转录组测序数据（RNA-seq），或者二种技术结合起来更好。「WGS鉴定出的基因融合」，基本能确定是由于基因组层面发生某种变异而引起的，但如果没有转录组测序数据，就无法准确判断融合后产生的新基因是否能够表达，或表达量的高低。而「转录组测序数据鉴定出的基因融合」，可以明确是能表达的基因融合，但却无法完全确定是否是由基因组变异产生的，还是来源于两个不同基因转录后发生的RNA融合。因此，如果条件允许，同时结合全基因组测序和转录组测序来鉴定基因融合，能够获得更准确的鉴定结果。

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「研究意义」：一些癌种的诱因，与癌症发生息息相关，前面文章中Gene panel设计时，gene fusion也是一类重要变异，如下图文（融合基因VS肿瘤）

基因融合与靶向药

基因融合生信分析可用「STAR」分析，其他软件如下图。

「基因融合事件发生主要机制」：易位，插入，颠倒，见下图

可变剪切分析

「研究的意义」：关注文章'施一公：人类已知的遗传疾病里，大约35%来自于剪接遗传’，如很熟悉的脊髓性肌肉萎缩（SMA）、阿兹海默症、地中海贫血症等。
可变剪接发生在转录过程的pre-mRNA和mature mRNA之间，RNA剪接体移除内含子，外显子以不同数目重新整合（如下图），产生多个转录本，多个转录本翻译成不同蛋白，使得蛋白丰富多样。

生信分析时可用ASprofile对StringTie组装的转录本进行可变剪切分析，统计「可变剪切事件类别和表达量」，常见的可变剪切事件类别如下图，包含外显子跳跃、内含子延伸、5' 端或3' 端等。

Reference

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  • Conesa A , Madrigal P , Tarazona S , et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis[J]. Genome Biology, 2016, 17(1):181.
  • http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/good_sequence_short_fastqc.html
  • 公众号文章：RPKM, FPKM, TPM有什么区别？
  • https://hrjournal.net/article/view/2693
  • https://www.tumorfusions.org/
  • https://www.meiwen.com.cn/subject/bieeqhtx.html
  • http://tech.sina.com.cn/2017-10-29/doc-ifynhhay8118096.shtml
  • https://www.cnblogs.com/aipufu/p/11615336.html
  • 「https://www.nature.com/articles/nrc3947」
  • https://academic.oup.com/nar/article/44/5/e47/2464672
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