2篇论文提供重要证据：PARP抑制剂，竟然也是免疫疗法？
杂志：Cancer Discovery
领域：癌症免疫
亮点：
1）在小细胞肺癌中，靶向DNA损伤（如抑制PARP）可显著增加PD-L1的表达，通过STING介导的T细胞激活促进抗肿瘤免疫。PARP抑制剂联合抗PD-L1疗法可显著增强肿瘤消退。
2）在BRCA缺陷三阴性乳腺癌（TNBC）模型中，PARP抑制剂的功效依赖于瘤内STING通路激活诱导的CD8+T细胞募集。这一发现为联合PARP抑制剂与免疫疗法治疗TNBC提供了理论基础。
当前，靶向DNA损伤和修复已在多种肿瘤领域得以应用。其中，PARP抑制剂类抗癌药在BRCA突变肿瘤中具有显著的抑制作用，已获得包括治疗卵巢癌等在内的多个一线用药资格。近期，Cancer Discovery杂志发表了2篇关于PARP抑制剂通过调节免疫系统发挥抗癌作用的重要研究进展，STING通路的激活在其中发挥了关键作用。
图片来源：Cancer Discovery
论文一：在小细胞肺癌中，靶向DNA损伤可通过STING介导的T细胞激活促进抗肿瘤免疫
小细胞肺癌（SCLC）常伴有相对较高的免疫抑制、低水平的T细胞浸润和抗原呈递减少等特征。与此一致，在临床试验中，PD-1或PD-L1阻断对于SCLC患者来说，总体响应率较低。最近的研究已经证明了靶向DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）途径作为SCLC治疗策略的潜力，包括靶向聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）和检查点激酶1（CHK1）的药物，但科学家们对靶向DDR的免疫激活特性知之甚少。
在该篇论文中，来自MD Anderson癌症中心和斯坦福大学的科研人员发现了靶向抑制CHK1和PARP在调节T细胞方面的作用，确认了CHK1或PARP的药理学抑制增加了肿瘤浸润性T淋巴细胞的水平，并在多个SCLC模型中揭示与抗PD-L1疗法的协同作用。
研究首先表征了靶向DDR对SCLC模型中PD-L1表达的影响。研究人员使用PARP抑制剂奥拉帕利处理一组人SCLC细胞系72小时，并通过反相蛋白质阵列（RPPA）、免疫印迹和流式细胞术进行表达检测。分析结果表明，靶向DDR显著增加所有被测试细胞系中PD-L1蛋白的总水平，提示使用奥拉帕利治疗可显著增加PD-L1表达（最多3倍，图1A）。通过基因敲除手段，研究进一步验证PARP抑制确实增加了PD-L1表达。在使用CHK1抑制剂（Prexasertib）时体现了类似的结果。
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接着，为了测试PARP抑制对免疫微环境反应的影响，科学家们使用PARP抑制剂（奥拉帕利）和抗PD-L1疗法进行了单药和联用研究。与之前的报道一致，奥拉帕利单药治疗对SCLC没有显著的抗肿瘤活性，抗PD-L1疗法单药治疗在这些模型中也没有显示抗肿瘤作用（图4A）。然而，在奥拉帕利和抗PD-L1联合治疗组却观察到动物肿瘤显著消退，效果甚至持续到第80天（图4A、4B）；奥拉帕利+抗PD-L1治疗组的总存活率显著高于抗PD-L1或奥拉帕利单药治疗组（图4B）。
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进一步的研究确认，靶向DDR后的抗肿瘤免疫应答通过SCLC中的STING-TBK1-IRF3途径介导发生。在使用奥拉帕利处理多个SCLC细胞系（H82、H526、H1048）中观察到STING途径激活，其中，靶向PARP以时间依赖性方式增强pSTING_S366、pTBK1_S172、cGAS和pIRF3_S396的表达（图5B）。在处理后21天，从小鼠RPP和自发性肺RPP模型收集的奥拉帕利治疗的肿瘤中也观察到STING途径的激活（图5B）。相反，当SCLC细胞系用不诱导DDR的药物（如紫杉醇）治疗时，没有观察到PD-L1或任何主要STING途径的表达发生。
IFN调节因子3（IRF3）先前已被鉴定为I型干扰素基因的转录因子，特别是IFNβ。由于靶向DDR导致IRF3的激活，研究人员预测，靶向DDR后IRF3水平的增加将增强IFNβ mRNA的表达。实验证实，奥拉帕利处理以时间依赖性方式引起多个SCLC细胞系中IFNβ的mRNA表达显著增加（图5C和5D）。在SCLC RPP-mTmG体内肿瘤中观察奥拉帕利（图5F）处理后IFNβ表达的类似增强；相反，用紫杉醇处理不会引起IFNβ mRNA表达的任何明显变化，这进一步证明STING介导的I型干扰素的激活是DDR靶向介导的。值得注意的是，通过免疫印迹分析证实，siRNA介导的IRF3敲低消除了奥拉帕利（图5H）介导的IFNβ mRNA表达的上调。同时，由于I型干扰素途径可以调节PD-L1表达，接下来研究分析了IRF3对PD-L1表达的作用，证实IRF3敲除消除了奥拉帕利（图5J）治疗后PD-L1蛋白表达的增加。
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接下来，研究人员试图确定联合DDR/PD-L1阻断的协同抗肿瘤作用是通过肿瘤细胞cGAS介导的STING活化程度来实现的。为实现此目的，在SCLC RPP/mTmG细胞中耗竭cGAS或STING，并通过蛋白质印迹分析确定了敲低效率，然后将cGAS或STING耗竭的肿瘤细胞注射到免疫活性小鼠中，并用奥拉帕利单独或联用抗PD-L1治疗。研究人员观察到，相对于对照组，在cGAS或STING敲低的肿瘤中，肿瘤消退程度显著降低（图6A和6B）。与对照组肿瘤相反，所有cGAS和STING敲低肿瘤即使用PARP和PD-L1联合阻断也有进展，这证实了在SCLC模型中，cGAS/STING在DDR介导的抗肿瘤免疫反应中具有重要作用。
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总结来说，该研究不但揭示了PARP抑制剂在免疫激活途径中的作用，而且为PARP抑制剂与PD-L1抗体联用提供了理论支持。
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论文二：在BRCA缺陷三阴性乳腺癌模型中，PARP抑制剂的功效依赖于瘤内STING通路激活诱导的CD8+T细胞募集
目前，联合PARP抑制剂与免疫疗法的临床试验正在进行中，然而，PARP抑制剂的免疫调节作用尚未完全研究清楚。在这篇论文中，来自Dana–Farber癌症研究中心的科研人员试图剖析PARP抑制剂诱导BRCA1缺陷三阴性乳腺癌（TNBC）肿瘤微环境变化背后的机制。
研究证明，PARP抑制剂奥拉帕利可在体内诱导CD8+T细胞浸润和活化，且CD8+T细胞耗竭严重损害抗肿瘤功效。奥拉帕利诱导的T细胞募集是通过肿瘤细胞中cGAS/STING途径的激活以及树突状细胞的旁分泌激活介导的。与HR-成熟（HR-proficient）TNBC细胞和体内模型相比，该效应在HR-缺陷TNBC细胞和体内模型中更显著。利用CRISPR敲除癌细胞中的STING阻止了促炎信号传导，并且在体内足以消除奥拉帕利诱导的T细胞浸润。
为了确定奥拉帕利诱导的细胞毒性T细胞募集是否通过cGAS/STING信号传导介导，研究人员检测了在KB1P-G3-/+BRCA1同基因配对细胞系中STING途径的激活，并观察了DNA传感器cGAS。研究结果显示，用奥拉帕利处理显著增加KB1P-G3-BRCA细胞中cGAS结合的微核的形成，但未在KB1P-G3+BRCA1细胞中观察到这一变化。接下来，研究人员评估了STING途径效应TANK结合激酶1（TBK1）的激活，发现奥拉帕利可诱导KB1P-G3-BRCA细胞中的TBK1磷酸化，导致TBK1的激活。研究还测量了IRF3的表达，其通过Ser396上的磷酸化在TBK1下游激活，与用奥拉帕利处理的KB1P-G3+BRCA1细胞相比，BRCA1缺陷细胞的pIRF3荧光强度显著更高。为了评估奥拉帕利诱导的cGAS/STING活化是否导致促炎细胞因子的产生，研究人员测量了已知主要由STING依赖性信号传导的IFNβ的表达。结果表明，奥拉帕利显著上调KB1P-G3-BRCA细胞中IFNβ的mRNA水平，但不显著上调KB1P-G3+BRCA1细胞中IFNβ mRNA的水平。之后，研究人员进一步检测了促炎趋化因子CCL5和CXCL10的表达，这些趋化因子与TNBC中STING/TBK1/IRF3依赖性信号传导和T细胞浸润有关。与IFNβ类似，奥拉帕利处理的KB1P-G3-BRCA细胞中CCL5和CXCL10的mRNA水平显著更高。
进一步的体外研究证实，PARP抑制剂通过STING/TBK1/IRF3途径诱导抗肿瘤免疫反应。为了确认这一研究结果，以及为确定观察到的TBK1/IRF3信号传导的激活是否由PARP抑制剂的直接作用所致，研究人员从骨髓中分化树突状细胞（DC）并在奥拉帕利存在下进行培养。虽然STING激动剂DMXAA在DC中有效诱导TBK1磷酸化，导致其活化（CD40 +）和成熟（MHCII +），但奥拉帕利不影响这些标志物的表达。这些结果表明，PARP抑制剂在体内先有效激活了BRCA1缺陷型肿瘤细胞中的cGAS/STING途径，导致随后激活DC中的TBK1/IRF3信号传导，进而刺激抗原呈递并因此刺激CD8+T细胞浸润和活化。
为了确认奥拉帕利在HR缺陷型人TNBC中能否更有效地激活STING途径，研究人员利用BRCA1缺陷型MDA-MB-436细胞及其同基因BRCA1重构和长时间暴露PARP抑制剂后获得奥拉帕利抗性的MDA-MB-436细胞来展开相关研究。分析结果显示，奥拉帕利显著增加了BRCA1缺陷型MDA-MB-436对照细胞中cGAS结合的微核的数量，但在BRCA1重构或PARP抑制剂抗性细胞中未检测到该变化；与cGAS活化一致，在BRCA1缺陷型MDA-MB-436对照细胞中奥拉帕利治疗显著诱导cGAMP合成。流式细胞术分析显示，与亲本和对照细胞相比，PARP抑制剂抗性和BRCA1重构的MDAMB-436细胞中响应于奥拉帕利的TBK1磷酸化受损；与之一致的是，奥拉帕利在HR缺陷型MDA-MB-436细胞中有效诱导TBK1磷酸化，但在BRCA1野生型（wt）HR-成熟MDA-MB-231细胞中没有诱导TBK1磷酸化。另外，通过测量pIRF3荧光强度，在用奥拉帕利治疗后，在存在BRCA表达的情况下，免疫显微镜检测荧光表达显著降低。通过流式细胞术和免疫荧光显微镜测量，TBK1/IRF3活化与DNA损伤的诱导相关。更重要的是，cGAS/STING途径激活不是奥拉帕利特异性的，PARP抑制剂维利帕尼和他拉唑帕尼也能诱导cGAMP合成、TBK1磷酸化和促炎细胞因子的产生，并且在BRCA缺陷细胞中比BRCA正常细胞中更有效。总结来说，这些数据表明，与HR成熟的人类TNBC细胞相比，在HR缺陷细胞中，PARP抑制剂可激活STING/TBK1/ IRF3途径，并随后更有效地产生I型IFN。
科学家们认为，该研究阐明了PARP抑制剂在激活STING通路中的额外作用机制，表明，通过激活癌细胞STING途径诱导CD8+T细胞募集可作为PARP抑制剂治疗TNBC疗效的关键决定因素。这些发现为联合PARP抑制剂与免疫疗法治疗TNBC提供了理论基础。
相关论文：
[1]Triparna Sen et al. Targeting DNA damage response promotes anti-tumor immunity through STING-mediated T-cell activation in small cell lung cancer.Cancer Discovery（2019）.
[2]Constantia Pantelidou et al. PARP inhibitor efficacy depends on CD8+ T cell recruitment via intratumoral STING pathway activation in BRCA-deficient models of triple-negative breast cancer. Cancer Discovery（2019）.
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