好的Idea+多数据库结合免疫组化发10分SCI！
Enhanced B7-H4 expression in gliomas with low PD-L1 expression identifies super-cold tumors在PD-L1低表达的胶质瘤中B7-H4的高表达可鉴别“超冷”肿瘤
一、研究背景
随着免疫检查点抑制剂（ICIs）技术的发展，肿瘤免疫疗法取得了巨大突破。PD-L1作为一个常见的预测标志，可以被用于抗PD1/PD-L1疗法的疗效预估。但在胶质瘤中，单独使用PD-L1作为疗效预测标志的可靠性尚存在不足。作者希望通过对一个潜在的预测标志B7-H4进行研究，来提高对胶质瘤免疫治疗疗效预估的可靠性。
二、研究思路
三、结果解读
1.PD-L1和B7-H4在胶质瘤中的表达情况
为了保证结果的客观性，作者在进行免疫组化之后邀请了两位对免疫组化样本来源病人的临床情况不了解的评估员来对免疫组化结果进行评分。对PD-L1, B7-H4和CD3的免疫组化染色结果评分采用等级制，对CD163染色结果的评分采用百分比制。其中，对于PD-L1, B7-H4的免疫组化评分来说，得分大于0为阳性，0-2分为低表达，3-6分为高表达。
作者通过分析免疫组化评分发现，大部分（61%）首次确诊的患者胶质瘤组织PD-L1是阳性的，但只有23.4%的首次确诊患者PD-L1高表达；在多形性胶质母细胞瘤（GBM）与较低级别的胶质瘤（LGG，Ⅱ和Ⅲ级）中，都表现出了PD-L1阳性样本多但高表达少的趋势。而在同一组样本中，B7-H4阳性和高表达的百分比分别为54.1%和19.6%；在GBM组中这两个百分比分别为53.8%和14.1%；在LGG组中这两个百分比为54.2%和24.4%，高表达与阳性的比值较PD-L1要高。
作者随后对PD-L1/B7-H4的表达与病人的临床病理学特征进行相关分析，发现PD-L1的表达与肿瘤生长部位，组织学分类，WHO分级和IDH突变情况显著相关；而B7-H4的表达与性别，组织学分类，WHO分级，TERT基因突变情况和染色体1p19q是否存在联合缺失显著相关（补表6）。通过以上研究，作者对PD-L1和B7-H4建立了初步的认知。
补表6：PD-L1/B7-H4的表达与临床病理学特征的关系
2.PD-L1和B7-H4的共表达情况
作者在分子层面对胶质瘤进行了划分，根据PD-L1和B7-H4的表达情况将免疫组化样本分为四个亚组（图1A）：
Double-High subgroup：PD-L1和B7-H4均为高表达，占2%
Double-low subgroup：PD-L1和B7-H4均为低表达，占61%
High-PD-L1 subgroup：PD-L1高表达，B7-H4低表达，占20%
High-B7-H4 subgroup：B7-H4高表达，PD-L1低表达，占17%
四个亚组的典型免疫组化染色结果展示于图1B。
作者通过相关分析发现上述不同分组的组织学分类，WHO分级，IDH突变情况，TERT基因突变情况和染色体1p19q是否存在联合缺失存在显著差异（补表7）。
从上述分组的占比情况可以看出，PD-L1与B7-H4均高均低的组合占63%，一高一低的组合占37%，提示两个基因可能存在有限的共表达，为了进一步验证上述推论，作者随后分析了根据PD-L1和B7-H4免疫组化染色结果评估得出的H-score（范围0-300，≥5为阳性结果）并对TCGA和CGGA数据库获得的RNA-seq数据进行了相关分析，也观测到PD-L1和B7-H4存在有限的共表达（图2）。此外，作者发现其它的已证实可作为治疗靶点的免疫检查点分子中大部分和PD-L1存在共表达，而与B7-H4存在表达互斥（图2），以上结果提示PD-L1和B7-H4基因有一定的独立性，为下文中的研究打下了基础。
图1：免疫组化样本分组情况及各典型染色结果
图2：PD-L1，B7-H4与免疫检查点分子表达的相关分析
补表7：PD-L1/B7-H4亚组与临床病理学特征的关系
3.PD-L1/B7-H4 classifier gene 筛选及GO富集分析
作者将 classifier gene 定义为与某基因共表达的基因，如CASP1基因、CCR5基因和PD-L1基因存在共表达，那么就可以将CASP1、CCR5基因称为PD-L1的 classifier genes。作者希望通过寻找PD-L1/B7-H4的 classifier genes 来探索PD-L1/B7-H4参与的关键信号通路，从而有助于从分子角度以另一种参考给胶质瘤进行分类。
作者在TCGA的转录组数据（n=666）中应用双加权中值相关算法（bicor）得到了62个PD-L1的和35个B7-H4的 classifier genes，对这些基因的GO富集分析发现他们在免疫应答和细胞通讯过程中显著富集，提示上述两个基因可能参与对应过程。
4.通过PD-L1/B7-H4的 classifier genes 区分胶质瘤亚型
根据预测得到的PD-L1/B7-H4的 classifier genes 的表达概况，可以重新将来自TCGA数据库的不同等级（2,3,4级）的胶质瘤分为三个亚类（图3A）：
Double-low modules：PD-L1和B7-H4的 classifier genes 均为低表达；
High-PD-L1 modules：PD-L1 classifier genes 高表达，B7-H4 classifier genes 低表达；
High-B7-H4 modules：B7-H4 classifier genes 高表达，PD-L1 classifier genes 低表达。
作者发现新分的三个亚类与先前免疫组化样本分得的四个亚组出现了不一致，为了进一步证实前者的合理性，作者将来自CGGA的转录组数据进行聚类分析，发现使用共性分类相关系数（CPCC）评估法得到的最佳聚类数是3，印证了三亚类分法的合理性（图3B）。
作者进一步分析发现，在不同等级（2,3,4级）的胶质瘤中，三个亚类的临床病理特征（年龄，组织学分型，TCGA分型等）存在显著差异。
此外，作者将TCGA分型与根据 classifier genes 进行的分类数据共同分析发现，TCGA分类中的间叶细胞亚型几乎都属于 High-PD-L1 亚类，而 High-B7-H4 亚类主要被包含在TCGA分型的原神经细胞亚型中，提示TCGA分型与上文提到的三亚类分法可能存在有一定的的联系。
图3：TCGA和CGGA数据库胶质瘤转录组数据分析结果
5.PD-L1/B7-H4的表达与免疫微环境
从先前的GO富集分析中可以发现，PD-L1/B7-H4的 classifier genes 与免疫应答存在相关，且因PD-L1与B7-H4存在一定的独立性，故作者推测由PD-L1/B7-H4 signatures 界定的两个 gene modules 在肿瘤微环境中会展现不同的免疫特征。
为分析PD-L1/B7-H4的表达与免疫微环境的关系，作者通过ESTIMATE包对TCGA数据库的胶质瘤数据进行了分析，发现 High-PD-L1 module 有更高的免疫细胞浸润得分，而 High-B7-H4 module 则有更低的免疫浸润得分（图4A），High-B7-H4 module 因为免疫细胞浸润少的缘故而肿瘤纯度（肿瘤样本中癌细胞所占的比例）更高（图4B）。
为了对上述发现提供更多的数据支持，作者计算了23种免疫细胞在不同 modules 中的基因集变异分析（GSVA）得分后，发现 High-B7-H4 module 的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）相对于其它亚类显著偏少（图4C）。后续作者再通过胶质瘤中不同免疫细胞分析得出的免疫浸润绝对分数证实了 High-B7-H4 module 的肿瘤相对于 High-PD-L1 module 的肿瘤存在更少的TILs和TAMs。对来自CGGA数据库的胶质瘤数据集进行分析之后也发现 High-B7-H4 module 胶质瘤的肿瘤微环境中TILs缺乏，相关分析揭示了B7-H4表达水平与TILs和TAMs的存在的负相关。
在生信分析之后，作者又进行了实验验证，对组织芯片中CD3和CD163的免疫组化染色结果分析后发现，High-B7-H4 subgroup 的肿瘤表现为“超冷”状态，相对于 High-PD-L1 subgroup 来说TILs和TAMs更少。（这里的“超冷”原文为“super-cold”，冷肿瘤指肿瘤组织中没有或者只有很少的免疫细胞。作者通过使用“超冷”这种说法，可能想表达的是免疫细胞极少甚至没有的一种肿瘤微环境状态）
最后，作者使用MSigDB数据库的两个基因集进行了基因集富集分析（GSEA），发现许多免疫应答相关通路会在High-PD-L1 modules 胶质瘤中上调，比如T细胞受体信号通路。差异表达基因（DEG）分析观测到了两个 modules 之间基因表达的显著差异，这可能预示着High-B7-H4 modules 在免疫治疗中对应更差的疗效。
图4：TCGA胶质瘤数据免疫评分，肿瘤纯度及GSVA分析结果
看到这里，作者的论证思路就比较明确了——先通过免疫组化结果得到PD-L1与B7-H4在胶质瘤之中的表达情况，并分析了一下两个基因的表达与临床病理特征之间的联系，对其建立初步的认知；随后作者根据基因表达情况将样本分成四个亚组，并通过观察分组占比情况及相关性分析，证明PD-L1与B7-H4存在有限共表达（存在一定独立性）；再然后，作者分别筛选了PD-L1/B7-H4的 classifier genes 并做了GO富集分析，证明二者在免疫应答及细胞通讯中的作用（两条通路都与肿瘤免疫密切相关）；根据 classifier genes，作者将样本分为了三个 module并通过CPCC评估法证明了分类的合理性，在三个 module 中，也观测到了临床病理特征的差异；最后，作者着重证明了B7-H4 module 在肿瘤微环境中对应更少的免疫细胞浸润、更高的肿瘤纯度、更弱的免疫相关通路上调，并提出了“super-cold”超冷肿瘤的概念，上述结果提示胶质瘤在PD-L1低表达，B7-H4高表达的情况下趋于表现为“超冷”状态，免疫治疗的疗效可能较差。
小结
作者从PD-L1与B7-H4的免疫组化染色结果入手，通过使用相关分析，差异分析，共表达分析，NMF，GO富集分析，PCA等统计分析手段对来自免疫组化，GCTA，CGGA以及MSigDB数据库的数据进行了分析，揭示了PD-L1和B7-H4在胶质瘤中的表达与临床病理学、肿瘤免疫学特征的关系，详实的数据和严谨的论证逻辑给予文章较高的可信度和较强的说服力。