皮下荷瘤实验的介绍及应用(二)
第二部分:裸鼠皮下荷瘤步骤
一般更多的时候是选择人源肿瘤细胞系,然而由于存在免疫排斥,需选择裸鼠荷瘤。
下面以裸鼠为例,为大家详细介绍皮下荷瘤的实验过程
⑴ 肿瘤细胞的传代扩增
取冻存于液氮的肿瘤细胞复苏并扩增,确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态
⑵ 计算细胞接种量
根据经验,一般鼠源肿瘤细胞接种2~100万/只,而人源肿瘤细胞则需要200-1000万/只以上。当然最好结合文献来确定细胞接种量,在找不到相关资料的情况下,最高就用到1000万/0.1ml,不可再高(因为细胞悬液已达饱和状态)。并且提前计算确定细胞数量,一般注射40只小鼠,至少需要准备50只小鼠的细胞量。
⑶ 准备裸鼠
一般选择5-6W裸鼠,小于4W动物可能不耐受而过早死亡,大于6W免疫力会增强,不易成瘤;
每批实验只用同一性别动物,通常雌雄均可,但是根据研究的肿瘤类型及肿瘤细胞系选择(乳腺癌等要选择雌性,前列腺癌等要选择雄性)
⑷ 操作步骤(请观看视频)
① 接种时选择好部位进针,建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置;
② 向前方穿行,注射前针头稍微动一动,能动说明在皮下,否则可能在皮内或者肌肉内;
③ 针头在皮下走一段再注射,速度不可太快,一般体积为100-200μL(PBS或者无血清培养基稀释细胞,若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤),可看见明显的鼓包;
④ 接种点离进针点尽量较远,减少漏液和污染的可能;
⑤ 注射完毕后,缓慢退出针头,尽量避免漏液;
⑥ 细胞需一直置于冰上,使细胞处于比较低的代谢状态,一般2h之内不会有问题。
下面为皮下荷瘤视频(包括各个部位的注射手法):
第三部分:后续实验安排
⑴ 分组:一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测,因此我们一般分为对照组,阳性药物组,低剂量、中剂量及高剂量药物组等;
⑵ 数量:荷瘤时每组不少于10只,考虑到小鼠成瘤率和死亡原因,最终实验应至少可以获取6个有效数据;
⑶ 给药时间:一般接种7-10天后便可看到肿瘤长起,便可分组实验(鼠源细胞系会更快);
⑷ 人道终点:动物伦理学规定,小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%,平均肿瘤直径不超过20mm,并且如果出现溃烂,造成感染或坏死时,应该中止实验且对动物施行安乐死。
补充正常免疫小鼠的荷瘤
基本步骤与裸鼠荷瘤一致,只是比较繁琐的是,由于野生型小鼠有毛发,所以需要剃毛(如上图Balb/c小白鼠腹股沟皮下荷瘤鼠源结肠癌CT26)
第四部分: 皮下荷瘤的几点问答
⑴ 瘤子长不出来是怎么回事?
一方面可能是细胞状态差,活力不好,或是肿瘤细胞不易成瘤,需加入Matrigel辅助或增大接种量或更换细胞系;一方面可能是小鼠周龄太大,或小鼠免疫排斥,建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠(Nod-scid小鼠,NOG小鼠> Nude裸鼠)
⑵ 小鼠瘤子长起来又消失?
肿瘤块先缩小,后变大很常见,很可能是炎症反应,肿瘤细胞被小鼠自身吸收,继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来,长不起来建议换鼠。
⑶ 均一性很差,肿瘤体积差距较大?
如果荷瘤分组发现小鼠肿瘤体积差距很大,这可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导致,建议重新做实验分组。
⑷ 是否可以在一只小鼠进行多个点荷瘤?
不可以,一只老鼠就只能接种一个点。因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下,可能会相互影响。
⑸ 是否应用免疫抑制剂加速肿瘤生长?
如果裸鼠荷瘤不生长,可以参考文献,用免疫抑制剂如环磷酰胺(抑制裸鼠NK细胞活性)促进生长;不过最好不要为了缩短造模周期来加速生长,因为可能会造成溃烂,这样就不得不中止实验。所以一般情况下,应尽量符合细胞系本身的生长特性,不应过多地人为的干扰。
皮下荷瘤实验介绍就到此结束了,原来看似简单的实验却有多种不可忽视的因素需要考虑。
简单回顾一下,皮下荷瘤模型中细胞系和小鼠品系是最需要考虑的两大因素,切记一定要多查阅文献并结合预实验,进而找到最合适的皮下肿瘤模型。