肺癌A549细胞单次大剂量放疗前后细胞膜磷脂含量变化研究

吴文安，李厨荣，冯波茹，赵金

陕西省肿瘤医院

四川省肿瘤医院

　　目的：探讨经单次大剂量放疗前后肺癌A549细胞膜磷脂含量的变化，研究细胞膜磷脂代谢及信号传导途径与肺癌A549细胞放疗反应之间的关系。

　　方法：应用高效液相色谱法（HPLC）检测分析经单次5Gy照射后24小时肺癌A549和照射前细胞膜磷脂的含量，对比分析不同磷脂组分含量变化，并研究其含量变化与放疗疗效的关系。

　　结果：HPLC分析结果显示磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）3种膜磷脂含量在照射后降低，分别为PI：1.53 ± 0.07、1.09 ± 0.20，PE：51.69 ± 4.32、32.47 ± 6.60，PC：128.79 ± 7.40、82.70 ± 3.02，有统计学显著差异（P＜0.01），PS虽改变但无显著意义。

　　结论：肺癌A549细胞经单次大剂量照射后细胞膜磷脂含量发生了改变，并推测与肿瘤细胞，凋亡、坏死等信号传导有关，对其脂类变化的深入研究以及对探讨肺癌立体定向放射治疗具有重要意义。

通讯作者：赵金（[e-mail]）

原文参见：肿瘤代谢与营养. 2017;4(2):208-211.

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　　肺癌为世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率都居各类肿瘤的首位，治疗后的5年存活率不足20%【1】。据报道，2008年中国肺癌新发患者数为520000，死亡人数为450000，非小细胞肺癌约占肺癌总数的85%，其中早期肺癌约占患者总数的54%。外科手术治疗一直以来被认为是主要的治疗手段。但是合并内科疾病、老年患者及拒绝手术的患者，放射治疗是其主要治疗手段。立体定向放射治疗（SBRT）已被证明在治疗早期非小细胞肺癌中能取得良好的效果，尤其在增加靶区剂量、提高肿瘤局部控制率和减少周围组织损伤上有明显优势。目前SBRT已广泛应用于临床，特别是肺癌SBRT已成为不能耐受或不愿手术早期肺癌患者的主要治疗手段，其疗效不亚于手术治疗【2-4】，并有研究发现，立体定向放射治疗可以诱导机体抗肿瘤免疫的发生，并与免疫治疗联合可提高抗肿瘤疗效【5-7】。研究发现，肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞三大物质的异常代谢相关，近年来受到广泛关注。但是对于放疗后细胞膜的变化尚未见报道，细胞膜由磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）组成【8-10】。基于此，本研究应用高效液相色谱法（HPLC）分析经单次大剂量放疗后肺癌A549细胞膜磷脂组分的变化，研究肺癌SBRT过程中细胞膜磷脂组分的变化。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　人肺癌细胞株A549（西安交通大学医学院生物医学实验中心提供）置于RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、链霉素100μg / ml、青霉素100U / ml）中，在37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中培养；仪器：冷冻离心机；真空浓缩仪；色谱分析系统为LC-2010AHT液相色谱仪，配备紫外检测器和自动进样阀；色谱工作站为LC solution V1.22 SP1；冷冻真空干燥器；试剂：PI、PS、PE、PC标准品；色谱流动相为乙腈-甲醇-85%磷酸（100∶3∶1，V∶V∶V），采用μ色谱柱（3.9mm i.d.×300mm）；乙腈为国产光谱纯，甲醇、氯仿和磷酸为国产分析纯。

　　1.2　方法

　　1.2.1　细胞的照射

　　照射条件：X线（6-MV），剂量率2Gy / min，源皮距100cm，照射剂量为5Gy。照射完毕接种于6孔培养板培养24小时。

　　1.2.2　细胞膜的提取

　　细胞悬液以1000g离心20分钟，弃去上清，保留沉淀；用Tris低渗液重悬沉淀，4℃下超声破膜30分钟；破膜后于4℃下以1000g离心20分钟，取上清；（1）将上清于4℃下以10000g离心20分钟，弃去上清保留沉淀，即为细胞膜；（2）重复上一步骤；（3）将细胞膜沉淀在冷冻真空干燥器中干燥。

　　1.2.3　细胞膜的纯度鉴定【11】

　　用电子显微镜技术对细胞膜的纯度及膜结构进行鉴定，观察到细胞膜的片状物及由细胞膜卷曲形成的小泡，未发现其他细胞器和细胞成分。

　　1.2.4　细胞膜磷脂组分的高效液相色谱法测定

　　将1.2.2获得的细胞膜加入5ml Tris-HCl缓冲液制成悬浮液。取2ml悬浮液加入5ml CHCl3-CH3OH（2∶1，V∶V），振摇1分钟，加蒸馏水1ml，以3000g离心10分钟，液体分层。取下清液，真空浓缩仪中干燥，保存于-20℃。用氯仿溶解直接测定。流速1.0ml / min，检测波长205nm，检测灵敏度0.05Aufs，柱压3.4mPa。重复测量3次，测得PI、PS、PE、PC峰高的变异系数（CV%）均小于2%。

　　1.2.5　统计学分析

　　采用SPSS16.0软件进行统计学处理，对计量资料进行正态性检验，如符合则进行配对t检验，不符合则进行秩和检验。记数资料进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　放疗前与放疗后肺癌A549细胞的细胞膜组分产生了变化，见图1。细胞膜磷脂在肺癌A549细胞放疗前后细胞膜中含量的比较，见表1。

图1　细胞膜组分的HPLC测定结果

注：磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）

表1　肺癌A549细胞放疗前后细胞膜磷脂含量比较（x±s）

注：磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）

　　3　讨论

　　细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌、贯穿在其中及吸附在其表面的蛋白质组成。它不单是细胞的物理屏障，而且在细胞的生命活动中还发挥着细胞间信号检测与传递、物质运输、能量转换、细胞表面识别和细胞分化等许多复杂的功能。由于细胞外部化学信号无论是作用于细胞核的信号，还是作用于核外的信号，它们的传递都必须经由细胞膜，与细胞膜表面的受体结合或经膜表面的特殊部位，如膜通道，进入到细胞内发挥作用【12】。因此，细胞膜的结构和成分与细胞的功能有很大关系，在特定的生理条件下，细胞膜的结构及表面受体、离子通道等维持一定的比例和组成【13,14】。但是受到外界生物、物理感染或细胞癌变，细胞膜的结构及组成成分也会发生一定的改变【15-17】。研究发现，肿瘤细胞膜的结构及组成成分与正常细胞存在一定差异。并且研究发现，肿瘤细胞代谢过程中产生大量的丙酮酸被用于内源性脂肪酸的合成，无论其细胞外脂类水平高低【18-20】，不断为肿瘤细胞提供脂类供应和脂类前体物质的产生，以及细胞膜的产物及基于脂类的蛋白转录后修饰【21-23】。内源性脂肪酸大部分酯化为磷脂，作为肿瘤细胞的磷脂组成，因此肿瘤细胞膜的磷脂含量高于正常细胞。

　　X线作用于生物体主要通过直接作用和间接作用，直接作用指的是射线直接作用于DNA双链，引起断裂【24,25】；间接作用主要指射线与水作用过程中产生大量的自由基，产生的自由基再与细胞相互作用【26,27】。这些活性氧能直接或间接促使细胞膜过氧化，导致膜结构和功能损伤。导致其膜脂流动性、膜封闭能力明显降低，即细胞膜通透性增加，膜MDA含量和自氧化速率明显增加【28,29】，最终导致细胞信号传导异常，引起细胞凋亡、癌变等。

　　已有研究表明，细胞膜发生的变化对细胞功能的影响意义巨大，其改变了细胞与环境之间的物质流、能量流及信息流。几乎细胞所有的功能都与细胞膜上的蛋白和磷脂有关【30】。因此放疗过程中产生的大量氧自由基可使肿瘤细胞膜发生改变，影响细胞膜的功能。细胞膜主要由PC、PE、PS及PI组成，实验研究放疗前后肺癌A549细胞膜磷脂含量的变化，研究发现PI、PE、PC3种膜磷脂含量在肿瘤中增加且具有显著差异（P＜0.01），PS改变虽无显著性意义，提示X线照射可使细胞膜磷脂发生改变。有研究发现，PI可分解成三磷酸肌醇和甘油二酯两个第二信使参与细胞信号传导。启动细胞凋亡和修复基因【31】。研究发现细胞磷脂参与细胞信号传导，包括细胞凋亡、自噬修复等，对肿瘤细胞信号调节起重要作用【32】。研究肿瘤细胞放疗前后细胞膜磷脂成分变化规律，并深入研究其对癌细胞生物学行为影响的分子机制，对探讨肿瘤放射治疗特别是立体定向放射治疗具有重要意义。

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