近日，西班牙的研究人员在Nature Protocols杂志上发表综述，概览了细胞外囊泡的单囊泡分析技术的重要性、种类和最新进展。
细胞外囊泡(EV)是异质脂质容器，具有参与多种生物过程的复杂分子货物。这些囊泡与特定的生理特征密切相关，这使得它们在各种疾病的检测和监测中具有不可估量的价值。EVs通过主动触发遗传或代谢反应在病理生理过程中发挥关键作用。然而，它们结构和组成的异质性阻碍了它们在医学诊断和治疗中的应用。这种多样性使得很难确定它们的确切生理作用，以及不同 EV（亚）种群的功能和组成。目前用于 EV 表征的集成平均方法，例如蛋白质印迹或“组学”技术，往往会掩盖而不是揭示这些异质性。单囊泡分析（single-vesicle analysis，SVA）的最新发展使得克服这些限制成为可能，并促进了实际临床应用的发展。这篇综述讨论了当前分析单个囊泡的方法固有的好处和挑战，并回顾了这些方法对理解 EV 生物学的贡献。该文描述了这些最近的技术进步对 EV 的表征和表型、检查EV在细胞间通讯途径中的作用以及鉴定和验证EV作为疾病生物标志物的贡献。最后，讨论了使用微流体设备的创新单囊泡成像和分析方法的潜力，这些方法有望为微创预后系统提供快速有效的基础和实际应用。利用SVA技术可以解决的三个问题：（1）EV 异质性的表征，包括亚群、表面（膜蛋白和脂质）组成和囊泡含量，（2）EV膜的结构研究和可溶性蛋白质的分析以及在类似天然环境中探测这些蛋白质的代谢活性的分析，以及（3）EV成分和功能的表征。随着越来越多的研究人员强调准确的 EV（亚）种群分类和表型的重要性，到目前为止，已经开发了20多种新的单囊泡技术。其中许多使用旨在集成各种技术的微流体设备，以改进 EV 分类和检测。此外，其中几种方法已用于在单囊泡水平表征 EV。其中一些技术可以直接提供有关囊泡表面、成分、大小和形状的信息，而其他技术可能需要对选定的 EV 亚群进行上游物理化学表征，以进行表面分析、监测生物标志物的表达并对它们在体液中进行量化。这些技术进步应该有助于使用无创或微创方法为小样本量设计新的诊断设备。表 1 中列出了 12 种不同的方法。其中一些方法利用标记技术（例如荧光或纳米粒子涂层）来可视化 EV，而其他方法则使用无标记系统（图 1）。图1、该综述中讨论的主要SVA技术的示意图。图的中心显示了释放 EV 的细胞。a-i，这些技术可以分为两组：无标签（a-e）和基于标签（f-i）的方法。使用的方法分别是(a)冷冻电子显微镜、(b)AFM、(c)NTA、(d) RTM、(e) SP-IRIS、(f) hrFC、(g) ddPCR、(h)SRM和(i)荧光显微镜。图2、最近使用SVA技术研究的内吞和融合途径的示意图EV是细胞间通讯的关键驱动因素。了解它们的生物化学和生理作用对于阐明疾病进展、生理反应或环境调节等生物过程至关重要。EV 的异质性也非常显著，这通常会使它们通过大量和集成研究进行准确分析变得复杂，这些研究通常会歪曲其功能。事实上，EVs 包含几个种群，根据它们的形态或表型进一步分为亚种群。这些（子）群体可能具有特定的功能，或者几个（子）群体可能执行与相同的任务。使用SVA方法的研究代表了在生物系统中突出和精确定位特定 EV 表型的最令人鼓舞的尝试。虽然SVA方法非常适合于生物标志物发现所必需的 EV 的高分辨率表型表征，但它们可能不适合进行进一步的功能研究。到目前为止，这些方法仅在识别摄取和融合途径方面取得了成功，但系统模型或单囊泡技术的未来进步可能会鼓励它们更广泛地使用。最终，单囊泡技术将为描述基于EV网络的全新细胞间通信范式提供基础。Bordanaba-Florit G, Royo F, Kruglik SG, Falcón-Pérez JM. Usingsingle-vesicle technologies to unravel the heterogeneity of extracellular vesicles. Nature Protocols. 2021 Jun 16. Epub ahead ofprint. PMID: 34135505.
