MPB：沈阳生态所李琪组-​土壤线虫群落DNA提取、扩增及高通量测序

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图1. 土壤线虫DNA提取流程示意图。（相关结果来自课题组先前发表的文章（Du et al.,2020））三、线虫群落的扩增测序1.使用引物NF1-F/18Sr2b-R（Porazinska et al., 2009）对线虫18S rDNA V4区进行扩增。PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μl反应体系：5 × FastPfu Buffer 4 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，Forward Primer （5μM）0.8 μl，Reverse Primer （5μM）0.8 μl，FastPfu Polymerase 0.4 μl，BSA 0.2 μl，Template DNA 10 ng，最后使用灭菌PCR水补足至20 μl。2.线虫（NF1FF/18Sr2bR）PCR反应参数为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循环后最终在72 ℃终延伸10 min。扩增之后，PCR产物使用2 %琼脂糖凝胶电泳进行可视化（图2），使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences, Union City, CA, USA）进行纯化，并使用QuantiFluor™-ST（Promega, USA）对回收产物进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（Illumina, San Diego, USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 300文库。PCR文库构建是在引物上合成barcode，采用混合样品建库的模式。具体构建文库的步骤为: （1）连接“Y”字形接头；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR扩增进行文库模板的富集；（4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行双端测序。原始数据已上传至NCBI数据库（序列号：PRJNA580055）。

图2. 利用NF1和18Sr2b引物对进行PCR扩增的电泳图谱及PCR产物浓度。（相关结果来自课题组先前发表的文章（Du et al.,2020））结果与分析一、生物信息分析1.数据优化使用Trimmomatic软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）软件进行拼接：（1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基及质控后200bp以下的reads，去除含N碱基的reads；（2）根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10bp；（3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，去除无法拼接的序列；（4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配。2. OTU聚类使用UPARSE软件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根据 97%的相似度对序列进行OTU聚类，具体流程如下：（1）提取优化序列中的非重复序列，去除没有重复的单序列；（2）按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列；（3）将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。3. 分类学分析通过Blast搜索，比对NCBI NT数据库对物种进行分类注释。二、线虫DNA提取效率和测序深度比较利用浅盘法结合贝尔曼漏斗法提取富集线虫后，利用DNeasy Blood & Tissue试剂盒提取线虫DNA，注释的线虫序列占总序列的68.40%，平均每个样本的测序深度达到28978/样本。相比前人的研究结果（Sapkota et al., 2015; Peham et al., 2017; Griffiths et al., 2018; Treonis et al., 2018）（表1），经过对线虫的物理分离、富集以及试剂盒提取方法的改进，提高了线虫DNA的提取效率和测序深度，为利用高通量测序技术开展土壤线虫群落研究提供了技术参考。表1. 基于高通量测序不同提取方法线虫测序深度比较线虫DNA提取试剂盒测序深度（序列数）线虫占真核生物比例参考文献the PowerLyzer™Power Soil® DNA Isolation Kit3994/样本64.40%Sapkota and Nicolaisen, 2015PowerSoil® DNA Isolation Kit未提到2.50%Peham et al., 2017PowerMax Soil DNA isolation kit2175/样本未提到Griffiths et al., 2018PowerSoil® DNA Isolation Kit2175/样本MO BIO UltraClean® Tissue & Cells DNA Isolation kit32568/样本19.9%Treonis et al., 2018DNeasy Blood & Tissue Kit28978/样本68.40%Du et al., 2020注意事项1. 针对不同的土壤选择合适的土壤线虫提取方法是提取线虫DNA的关键步骤，在保证线虫富集效率的同时还要保证线虫悬液样本的清晰，土壤线虫提取方法的选择可参考张晓珂 等（2013）。2. 线虫引物和试剂盒在未来可能会进一步优化，需关注最新的研究进展选择合适的引物和试剂盒进行研究。3. 线虫高通量测序数据的处理可根据需求灵活分析，也可使用Usearch软件对原始测序序列进行质控，聚类，生成OTU表。4. 用于线虫分析的数据库对于分子技术在线虫领域的应用十分重要，今后需进一步补充和完善现有的线虫数据库。致谢本研究成果主要来源于课题组先前发表的相关文章(Du et al.,2020)。相关研究得到了国家科技基础资源调查专项项目(2018FY100304)、中国科学院国际合作局对外合作重点项目(151221KYSB20200014)和国家自然科学基金项目(41877047)的资助。参考文献1.张晓珂， 梁文举， 李琪. （2013） 长白山森林土壤线虫. 北京：中国农业出版社.2.Du, X. F., Li, Y. B., Han, X., Ahmad, W. and Li, Q. (2020). Using high-throughput sequencing quantitatively to investigate soil nematode community composition in a steppe-forest ecotone. Appl Soil Ecol. 152: 103562.3.Griffiths, B. S., de Groot, G. A., Laros, I., Stone, D. and Geisen, S. (2018). The need for standardisation: exemplified by a description of the diversity, community structure and ecological indices of soil nematodes. Ecol. Indic. 87: 43-46.4.Peham, T., Steiner, F. M., Schlick-Steiner, B. C., and Arthofer, W. (2017). Are we ready to detect nematode diversity by next generation sequencing?. Ecol Evol. 7: 4147-4151.5.Porazinska, D. L., Giblin-Davis, R. M., Faller, L., Farmerie, W., Kanzaki, N., Morris, K., Powers, T. O., Tucker, A. E., Sung, W., and Thomas, W. K. (2009). Evaluating high-throughput sequencing as a method for metagenomic analysis of nematode diversity. Mol Ecol Resour. 9: 1439-1450.6.Sapkota, R. and Nicolaisen, M., (2015). High-throughput sequencing of nematode communities from total soil DNA extractions. Bmc Ecol 15: 3.7.Treonis, A. M., Unangst, S. K., Kepler, R. M., Buyer, J. S., Cavigelli, M. A., Mirsky, S. B. and Maul, J. E. (2018). Characterization of soil nematode communities in three cropping systems through morphological and DNA metabarcoding approaches. Sci Rep-Uk. 8: 2004.