科研 | Nature Methods：脂质代谢的多路复用和单细胞示踪
编译：杨丽军，编辑：Emma、江舜尧。
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代谢示踪对于健康和疾病代谢通路的复杂性的理解是一重要的技术。脂肪酸大约包括三分之一的卡路里，然而对于这部分的代谢动力学的认识很局限，尤其是在个别物种的脂质水平。对于脂肪酸的示踪，作者之前引进了一个基于炔烃标记的脂肪酸，点击化学和荧光检测的系统。已经获得敏感和特定示踪的脂肪酸，固醇和鞘脂类代谢。各种标记的前体确保了代谢途径的广泛覆盖。该系统有两个主要局限性：首先，检出限在低的picomole范围内；其次，薄层色谱分离不包括脂质种类的分离。在基于质谱（MS）的脂质组学中获得的具有物种分辨率的示踪系统将为代谢分析开辟新的途径。
在使用稳定同位素标记的质谱示踪中，主要问题是在细胞提取的背景下鉴定同位素标记的化合物。虽然可以通过靶向分析发现已知物质，但标记的脂肪酸通过复杂分析被并入数百种产物中。因此，可用现有的同位素标记的脂肪酸示踪数据仅限于少数标记物种；缺少一种允许在物种水平上进行全面追踪的方法。如果能设计出一种可点击的报告分子，在功能上取代先前的荧光报告分子，则炔烃标记的脂质将在基于质谱的追踪中提供主要优势。这样的分子应该有助于标记产物的离子化，特异性增强其信号，提供可预测的质量偏移，从而可以在MS1水平上直接识别，并提供诊断碎片，以在MS2水平上搜索标记化合物。
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实验设计
使用点击化学质谱报道分子策略，作者为炔烃标记的脂质开发了一种特定的，高度敏感且稳定的示踪方法。该方法实现了样本多路复用，从而改善了样本比较。作者通过对肝细胞甘油脂代谢的时间分辨分析以及对120个标记脂质种类的平行定量监测证明了这一点。，毫微微克分子灵敏性可以对脂肪酸掺入中性和膜脂的单细胞进行分析。结果证明了脂质稳态在单细胞水平上的稳健性。
实验结果
1. 点击质谱报道分子
C171（图1a）提供了这些功能，其特征在于带电报告基、连接剂和叠氮基，用于与标称质量位移为171da的末端炔烃反应（图1b）。正电荷能有效电离，特别是对中性脂质如甘油三酯。C171最重要的特征是其在MS2实验中的意外碎片。在中等的碰撞能下，标记的化合物通过消除二甲基乙胺基表现出典型的中性缺失（NL）73.09Da（图1c）。未反应的C171不显示该中性缺失，表明三唑环辅助消除，形成双环结构（图1b）。这种73.09的中性缺失是中性脂类的判断反应，能够识别酰基甘油、神经酰胺、甾醇酯和游离脂肪酸。
磷脂表现出磷酸二酯头部基团的平行的中性缺失，导致形成[DAG-H2O]+（图1d）。双环三氮唑上的正电荷也有利于头部基团NL，而磷脂通常会丢失正的头部基团片段，即磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂（SM）。通过分析MS2中[头基+二甲基乙胺]的NL可有效地识别标记磷脂。对于PC和SM，双电荷、单标记峰也出现在质谱中。在m/z184.07+时，这些离子被NL为73.09的碎裂，伴随着磷脂头部基团的释放，导致256.15+的损失。LipidXplorer14将特征性前体质量和特征性片段化的组合用于自动识别标记的脂质，LipidXplorer14为计算中的前体，片段和化学逻辑提供必要的灵活定义。
在原代肝细胞的提取物中，用16-庚二酸（aPal），壬基9-顺-乙基三胺-18-炔酸（aOle）或八面体-十-9,12-二亚乙基三胺-17-炔酸（alino）标记，作者从17种脂质类别中鉴定出250种以上标记的物种，这些物种在源自三种不同标记的物种光谱中显示出特征差异。
为了通过内部标准化对痕量脂质进行绝对定量，作者合成了含有炔烃脂肪酸（磷脂酸PA，PC，磷脂酰乙醇胺PE，磷脂酰肌醇PI，磷脂酰丝氨酸PS，二酰基甘油DAG，三酰基甘油TAG，胆固醇酯CE，神经酰胺Cer和双标记的三酰基甘油dlTAG），其代表肝细胞中总脂肪酸含量的约96％。这些标准品还含有氘，导致天然脂质中找不到独特的质量，从而可以追踪奇数和偶数炔烃脂肪酸。
这些标准品的稀释系列用于测定测定的灵敏度和线性。除了PA的R2= 0.92，在很宽的浓度范围内都获得了线性响应（R2> 0.96）。中性脂质和PC显示最强的信号，而PS响应最弱。产生的灵敏度通常比未标记的内源性脂质好3-20倍。常规测量能够定量低至0.1pmol的标记TAG。
图1 点击质谱的reporters的结构和功能
a,本研究中点击试剂的化学结构.b,C171与末端炔烃的反应以及拟议的MS2裂解产物.c,d TAG（53：5）（c）或PC（37：5）（d）的主要片段在碰撞能量增加时（左）和最可能的结构（右）的碎片光谱都单击了C171。红色数字表示相应分子结构的主要（和诊断性）裂解峰。红色NL编号表示所得中性损失，用于鉴定相应的脂质类别。c和d中所示的实验重复了3次，结果相似。
2. 多路复用
在生物分析中，多路复用可增强样品通量，降低技术噪音并节省成本。液体处理中的定量变化，喷雾不稳定性和碎裂波动至少可以通过多路复用得到补偿。为此，作者合成了另一组试剂。与蛋白质组学中相对和绝对定量实验中的串联质量标签和同量异位标签中使用的逻辑类似，作者分配了重同位素，使得所有试剂几乎相同质量为175.18Da，但NLs在77和73 Da之间，并由连接子平衡（图1a和2a）。肝细胞用aPal脉冲标记5分钟，然后分别追踪0、5、20和40分钟，脂质提取物与不同的C175试剂点击反应，反应后混合，然后合并进行MS分析（图2b）。内标物DAG（32：3-d8）在m / z745.69处的四重MS2分析如图2c所示：二甲基乙胺部分的NL裂解产生了四个不同的质量，每个代表四个输入样品之一。正如内标所预期的那样，峰强度非常相似。变化是由于液体处理以及同位素杂质引起的。来自同一多重样品（图2c，右）的细胞衍生DAG（33：4）的并行分析显示强度差异代表了各个单一样品中的物种数量。
图2 多路复用代谢示踪
a，使用C175-XX试剂的MS多重策略的示意图。带标签的样本被提取并单独点击。合并这四个样本，并在MS1中给出一个峰，该峰分成MS2中的四个峰，每个峰代表其原始样品。b，用于追踪肝细胞甘油脂代谢的代谢的脉搏追踪实验的设计。c，以上实验的MS2质谱图，显示了DAG内标和细胞DAG。在追逐过程中，DAG迅速代谢（右），如标记的DAG（33：4）的信号减少所指示。c中所示的实验重复了12次，结果相似。
3. 肝细胞甘油脂代谢分析
为了分析脂肪酸代谢，作者用aPal或aLino脉冲标记的原代小鼠肝细胞5分钟，追踪0、5、20或40分钟，并处理样品，如图2b所示。神经酰胺和CE被排除在进一步分析之外，因为它们的定量贡献可忽略不计，PS由于信号微弱而未进行分析。
数据分析：用内标进行归一化，将绝对量相加，得出掺入脂肪酸的总量（图3a）。1200 pmol标记脂质相当于未标记细胞的平行脂质组学测定的总细胞脂质的1.4％。脂质类别的总强度以总摩尔数表示（图3b），表示标记的DAG快速代谢产生PC和TAG，而PE和PI的总分数在追赶期间缓慢增加。随着时间的流逝，侧链碳原子和双键的加权平均数增加（图3c，d），表明脂质类别的物种重塑。在脂质种类水平上对此进行了进一步分析（图4），其中在四个分析的时间点上显示了每种种类的相对丰度。请注意，作者指出了与aPal结合的脂肪酸，而不是种类名称。也就是16：0而不是DAG（33：2）。脉冲由aPal加a17：2（即双aPal）控制后，DAG的组成（图4a），16：0、16：1和18：1、18：2，并逐渐向较长且多不饱和的物种变化。PC（图4b）具有与DAG相似的组成，但有一些特征偏差：FA16：0和16：1的代表性不足，20：4和22：6的代表性较高。对于肝PC，FA18：2比18：1更丰富。随着时间的流逝，除了a17：2物种被降解到16：0物种的水平外，几乎没有变化。PE（图4c）包含90％的多不饱和FA（PUFA），几乎没有重塑，而PI（图4d）显示出20：4的特征优势，该优势随时间增加而以较短的脂肪酸为代价。
肝的PC合成是两个途径的组合：kennedy途径利用将3-磷酸甘油酰化为PA，随后的去磷酸化为DAG以及最终转移磷酸胆碱可产生PC。通过将磷酸乙醇胺转移至DAG，形成PE，并通过磷脂酰乙醇胺甲基化N-甲基转移酶也可以生产PC。在图4中，在追踪0分钟时DAG，PC和PE的比较表明，标记的PC池是通过将C16–C18DAG与C20–C22结合而形成的PE，与先前的观点一致，即磷脂酰乙醇胺 N-甲基转移酶途径在PC中贡献了大部分PUFA。
与aPal相似，用aLino标记的类别水平分析显示DAG迅速降低，而PC和TAG中相应增加。至于aPal，标记的PC从追逐20分钟到40分钟时略有下降。在六个独立实验的每一个中都观察到了这种微小的影响，很可能代表了将PC转化为TAG的途径。与aPal的观察相反，所有磷脂和DAG均显示出链长和双键随时间下降，而TAGs则显示出长度和双键数增加。在物种水平上（图5），DAG主要包含FAs 16：0、16：1、18：0和18：1。很少有FA20：4或FA22：6与aLino结合使用。在5分钟的追踪中，双aLinoDAG的初始强峰迅速降低（从310 pmol降至32 pmol），也观察到了PC和PE的相应物种。对于PC，追赶40分钟后，16：0-alino物种的比例稳定增加，直到成为优势，这与内源PC对FA16：0–18：2的偏好一致。PI发生了重塑，其中强大的双aLino和FA18：2组合迅速降解 FA18：1最初补偿了PUFA的减少，然后随着FA16：0和FA18：0成为主要种类而减少（从9％降至47％）。由于标记的PI的总量基本保持不变，因此大多数代表了实际的脂肪酸重塑，可能是DDHD1去除了sn-1脂肪酸，接着是LYCAT24酰化，其对FA18：0偏爱。
图3 实验的脂质类别水平分析概述于图2b
如图所示，将新鲜分离的肝细胞用aPal脉冲标记5分钟，然后追逐0-40分钟。使脂质提取物与C175试剂发生点击反应，合并并通过多重MS分析。使用LipidXplorer分析鉴定信号，并相对于内标信号定量。使用LipidXplorer分析鉴定信号，并相对于内标信号定量。a，b，所有分析类别的总掺入量（a）和相对数量（以标记类别的mol％为基准）（b）c，d，加权平均类别链长的变化（c）和双键数量（d）表示在脂质类中物种重塑。注意，d中的双键数目不包含用于标记的炔烃脂肪酸的三键。条形表示三个副本的平均值，各个值显示为黑色符号。该实验重复了3次，结果相似。
图4 用aPal标记的甘油脂的脂肪酸重塑
肝细胞按图3进行处理，并将信号标准化为相应类别总数的百分比。a-d，aPal与脂肪酸结合，如横坐标所示，得到DAG（a），PE（b），PC（c）和PI（d）。条形表示三个副本的平均值，各个值显示为黑色符号。该实验重复了3次，结果相似。
图5 用alino标记的甘油脂的脂肪酸重塑
a-d，肝细胞的处理如图。参见图3和4。aLino与脂肪酸结合，如横坐标所示，得到DAG（a），PE（b），PC（c）和PI（d）。条形表示三个副本的平均值，各个值显示为黑色符号。实验重复了3次，结果相似。
4. 单细胞代谢示踪
高灵敏度检测点击反应中性脂质。例如，将补充数据的样品以每分钟70个细胞的当量注入光谱仪，导致许多峰的强度>107。在Orbitrap检测器中，可以可靠地检测到103的信号强度，这表明每分钟单标记的细胞足以进行定量分析。
为了实现单细胞灵敏度，作者将样品量从500 µl减少到20 µl，通过有限稀释对细胞取样并鉴定出总共46种标记的PC，TAG和双标记的TAG。在每管0.5个细胞的标称浓度下，观察到一些标记脂质含量极低的样品（图6a，样品2和4-10）和两个含量较高的样品（图6a，样品1和3）。在较高的标称浓度下，低计数的频率降低了，并且强度发生了较大的变化，这与样品中细胞数的预期泊松分布一致。通过减去样本6–9的平均值，再乘以一个考虑样本稀释的因子，对背景数据进行校正。校正后的数据集（图6b）用于估计样品中的细胞数量。有一个人的总标记脂质介于120至290fmol之间。由于肝细胞以单核和双核细胞的形式出现，并且细胞体积变化很大，因此可以合理地假设该群体由单个细胞组成，而300至600 fmol之间的群体代表两个细胞。作者重复了该实验，以每个样品收集的0.8个细胞收集了更多的细胞，结果得到19个单个细胞用于进一步分析。种类模式与多细胞分析的种类模式基本相同，但定量极限降低到20 µl样品（10 pM）中的0.2fmol标记脂质。
为了分析单个细胞之间的代谢变化，计算了总标记物质的摩尔％（补充图8），并绘制了六个随机挑选的单个样品的所得光谱以及所有19个单细胞的平均值的光谱。数据证明了该方法的可重复性，但也显示了单个细胞之间的实质性差异。通过分析内标信号对绝对信号一致性的评估表明变异系数百分比值在30％左右。在按照内标标准化后，一些丰富的细胞物种的变异系数在10％左右，但还有一个次要物种的变异系数在15％以下，这说明了在低飞摩尔范围内测量的稳健性和精确性。3小时后，单细胞的平均总标记为每细胞433fmol，与上述5分钟标记多重实验中获得的每细胞16 fmol的计算结果相当。标记物种中脂肪酸的平均长度变化很小，而双键平均数变化更大。这些数据表明单细胞水平的肝细胞具有精确的
对生物合成物种模式的稳态控制，导致非常相似的单细胞脂质谱。
图6 在脂质类别水平上分析单细胞脂肪酸示踪
如方法中所述处理和分析新鲜分离的肝细胞。a，标记脂质类别的绝对数量（单标记PC，按测量顺序显示了样品的单标签TAG，双标签（dl）TAG）。b，通过减去样品6-10中发现的信号平均值，再乘以考虑样品标称浓度的因子，对背景信号进行校正，以校正图a中所示的数据。样品28、30和43包含超过1,000µpmol的标记脂质（a，5,675、1,179和1,856pmol；b，5,538、1,043和1,583pmol）。该实验重复了3次，结果相似。
讨论
单细胞代谢组学是一个年轻的动态领域。使用基质辅助激光解吸成像或微毛细管采样，可以检测脂质，并可以追踪某些代谢变化。本研究方法的主要优点是它的特异性，通过内部标准化进行绝对定量的定量性质以及使用标准MS仪器的方法。当前实验程序的一个缺点是仅有限的稀释方法以获得用于分析的单个细胞。专门的单细胞分配器将有助于将来制备单细胞。实验数据证明了该方法的可行性和功能性，鲁棒性及其在亚甲孔量的性能。已经有了有限数量的细胞，数据表明在单个细胞水平上存在针对脂质长度和饱和度的稳健的稳态控制机制。这既不排除存在明显偏差的小细胞群，也不排除器官范围内的调节机制。未来的研究将探讨从单个细胞到整个器官的不同尺度如何协同作用于脂质代谢的稳态控制。
整个方法关键取决于两个先决条件，即点击报道分子的性能以及炔烃前体分子的可用性和可靠性。点击报道分子极大地提高了敏感性和特异性，并能在MS的高灵敏度正离子模式下进行全面的脂质分析。在MS2分析中，试剂给出了特征性NL，因此标记的脂质主链仍然显示为带电片段。这提高了分析的特异性，因为每个标记的物质均由两个特定的离子定义，从而能够解析MS2中的同量异位物质，而带电报告离子（如184.07Da磷酸胆碱头基团）则无法实现。同样，定量分析得益于1 Da窗口中MS2扫描的高灵敏度，特别是对于单细胞测量。在这里，少数物种通常无法在MS1中给出峰，而在MS2中，可以检测到前体和碎片，从而可以明确鉴定和定量。报告子的另一个重要特征是样本多路复用的能力。这样可以节省四倍的时间和其他资源，减少随机实验噪声并改善样品比较。但是，在多路采样中，由于PS的峰与单电荷PC的峰部分重叠，因此无法识别。PC识别本身不受影响，因为它使用了双电荷PC峰。同样，通过峰的部分重叠妨碍了通过分析其DAG片段来确定TAG的亚种。然而，如上所述的多路复用的优点抵消了这些缺点。
为了广泛应用该方法，可获得许多不同的炔烃标记的前体分子，涵盖简单的脂肪酸，固醇和鞘脂以及复杂的脂质。本研究中的多路脉冲追踪实验说明了炔烃脂肪酸进行追踪的可靠性。通过aPal标记获得的数据表明，如对饱和脂肪酸所预期的那样，aPal主要掺入磷脂的sn-1位。在脉冲过程中，高浓度的aPal也导致掺入sn-2位置。这些双aPal物种对应于稀有的双饱和内源性磷脂，并且可能在Lands循环酶的作用下在sn-2处快速重塑。用alino标记会在脂肪酸稳态系统中产生逆平衡。作为PUFA，预期aLino将更喜欢sn-2位置。但是，在脉冲标记之后，发现大量双alino物种以及与FA20：4和FA18：2的组合，其中alino必须在sn-1位置大量存在。再次，细胞会迅速降解那些物种以用对应于优选内源物种的组合如16：0-alino替代它们。
尽管该方法能很好地追踪现有脂肪酸，但它既不能追踪乙酰辅酶A的新脂肪酸合成，也不能追踪通过β或ω氧化降解的脂肪酸，所有这些仍需常规使用放射性标记法进行测定。调整方法以研究β-氧化将是未来的有趣观点，以及组合多个标签以进行并行多标签多路复用。