科研 | Nat. Commun.：必需氨基酸的限制决定了系统对膳食蛋白稀释的代谢反应
编译：杨丽军，编辑：Emma、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
目前必需氨基酸(EAA)的分类是基于在没有氨基酸(AA)的饮食供应下的生长和活力的营养需求。然而，人类很少面临严重的蛋白质/氨基酸的缺乏，人类历史上，营养过剩首次意味着超重人口的数量在全球范围内超过了体重不足的人口数量，这需要重新考虑氨基酸在营养方面的功能。一种方法是膳食蛋白质稀释(DPD)，与热量限制不同，蛋白质减少，并被其他营养来源取代，不同于严重的蛋白质/氨基酸限制，这种限制与生命力不相容，适度的DPD促进多种物种的寿命，包括苍蝇，啮齿类动物，也许还有人类。此外，DPD还影响健康寿命，临床前研究表明，DPD可以延缓与年龄相关的疾病，如癌症，2型糖尿病，以及血脂异常/脂肪肝。值得注意的是，膳食蛋白质摄入量与人类患2型糖尿病的风险和全因死亡率呈正相关。
根据DPD的代谢健康和长寿可能涉及许多机制，但最近的研究表明，DPD通过组成氨基酸促进代谢和生理适应，这在很大程度上与肠道和肾脏中性氨基酸转运的遗传缺陷相似。特别是，限制饮食蛋白质或氨基酸通过肝源性激素成纤维细胞生长因子21(FGF21)促进这种代谢重构和健康，主要是通过增加相对于食物能量摄入的能量消耗。重要的是，DPD还增加了人类FGF21，这种增加与能量消耗增加和新陈代谢健康指数改善有关。然而，DPD效应是否需要同时增加其他非蛋白质/氨基酸营养物质，如某些碳水化合物，以及这一过程是由哪种特定的氨基酸驱动的，目前还存在争议。一方面，必需氨基酸的限制，如支链氨基酸和含硫的氨基酸，已被证明足以赋予DPD的全身效应；另一方面，其他人已经证明，改变的躯体非必需氨基酸代谢对DPD效应的充分和必要的。本文试图通过正式测试需要哪些特定的氨基酸来诱导对DPD的全身反应来解决这个问题，并表明特定的膳食必需氨基酸限制对于驱动对DPD的全身代谢反应是充分和必要的。
论文ID
实验设计
膳食蛋白稀释(DPD)促进新陈代谢重建和健康，但驱动这一反应的确切营养成分仍然难以捉摸。本研究通过模拟酪蛋白饮食中的氨基酸供应，证明了限制膳食必需氨基酸，而不是限制非必需氨基酸，会推动全身对完全缺乏氨基酸的代谢反应，且独立于膳食碳水化合物供应。此外，缺失苏氨酸和色氨酸，与氨基酸的总供给无关，对饮食的代谢反应和由氨基酸限制引起的遗传性氨基酸运输损失都是充分和必要的。饮食苏氨酸限制(DTR)可延缓肥胖相关代谢功能障碍的发展，且DTR的代谢重构需要肝源性成纤维细胞生长因子21。值得注意的是，肝细胞选择性的苏氨酸生物合成能力的建立逆转了全身对DTR的代谢反应。综上所述，在小鼠身上的研究表明，必需氨基酸的限制对DPD的全身代谢效应是充分和必要的。
实验结果
1. 必需氨基酸限制决定了对DPD的代谢反应
实验室之前的研究已经证明，DPD可以改善肥胖患者的糖脂平衡，氨基酸的稀释足以模拟这些效应，然而，对于是否能用其他膳食营养素(即碳水化合物和脂肪)或哪种特定的膳食氨基酸取代蛋白质的稀释仍有待解决。为了验证这一点，本研究给小鼠喂以蛋白质限制的饮食(从酪蛋白中摄取能量的5%)，并将其效果与饮食中减少的蛋白质成分以酪蛋白中发现的蛋白原性氨基酸取代的饮食进行了比较。实验证明，氨基酸加回逆转了蛋白质限制的效果，降低了血清尿素(图1A)，证实了纯化氨基酸的添加在生理上起到了蛋白质等价物的作用。此外，在蛋白质限制的膳食中加回氨基酸逆转了喂养效率的降低（图1B），这种改变的喂养效率反应在能量消耗（EE）上呈相反模式（图1C）；根据二氧化碳消耗（图1D）和产生（图1E）比率衡量，呼吸交换率（RER）没有差异；按照方差分析的判断，合并DPD的能量消耗的增加独立于测量期间的体重差异而发生（图1F），较高的能量消耗不能用改变的体力活动来解释(图1G)，与增加循环FGF21是DPD增加能量消耗的作用所必需的概念一致，发现血浆FGF21水平高度升高，这可被氨基酸加回逆转(图1H)。由于血液中FGF21水平的升高也赋予了DPD改善葡萄糖代谢的作用，本研究也通过测量两组空腹血糖的空腹胰岛素敏感性指数(ISI(F))(图1I)来评估这一点，DPD增加的ISI（f）确实与AA加回完全相反（图1I）。
虽然本实验证明氨基酸可能是这些效应的必要成分，但膳食碳水化合物是伴随调控的，并且可以潜在地解释这些反应，因为FGF21受到某些膳食碳水化合物的影响。此外，未鉴定具有DPD效应的特异性氨基酸，因为肝脏是“感知”DPD的重要器官，本实验最初研究了肝脏门静脉（图2A）和肝脏（图2B）氨基酸水平对DPD的反应。虽然大多数营养EAA在DPD患者的门静脉血浆和肝脏中较低，但某些非必需AAA(NEAA)，如ASN、Pro、Glu和Tyr也受到影响，这意味着必须采取更广泛的方法，而不仅仅是关注一类AA。为了检验这一点，进行了一项研究，在营养定义的基础上，特异调控了EAA和NEAA，并在一些饮食中补充氨基酸的替代来源，以保持氨基酸总供应量的恒定，而不改变饮食中的脂肪或碳水化合物供应(图2C)。值得注意的是，NEAA供应与尿液和血清尿素的含量比EAA供应高（图2D）正相关，并且EAA/NEAA供应与喂养效率之间存在非二元关系（图2E）。然而，限制EAA完全赋予DPD对EE(图2F)和血清FGF21(图2G)水平的影响，特别是，血清FGF21水平与总的EAA供应呈负相关(图2G)。
在这项研究中，还进行了糖耐量测试，以进一步检查饮食对全身新陈代谢的影响。血糖漂移(图2H)和曲线下的相关面积)与EAA供应直接相关，限制EAA可降低血糖水平，胰岛素也有类似的结果（图2I）。根据空腹血糖和胰岛素值，可以计算各种葡萄糖代谢控制指数，如ISI(F)(图2J)和HOMA-IR。此外，还计算了葡萄糖和胰岛素AUC的乘积。重要的是，空腹血糖和胰岛素测定的指数与葡萄糖耐量试验测定的指数之间有非常密切的相关性，所有这些指标都强调限制膳食EAA会提高糖代谢/胰岛素敏感性。
图1 膳食蛋白质稀释的系统代谢效应需要膳食氨基酸
A 用含20%蛋白质能量(20P)、5%蛋白质能量(5P)、5%蛋白质能量和15%氨基酸能量的饲料处理3周后的小鼠血清尿素水平。数据均为Mean±SEM，n=5只/组。与20P比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。与5P比较：#P<0.0 5，##P<0.01，###P<0.001。B小鼠的喂养效率，如(A)所示。C如(A)所述，小鼠在不同日间的能量消耗。D 小鼠不同日相的耗氧率(VO2)，如(a)所示。E小鼠不同日相的CO2生成率(VCO2)，如(A)所示。F 小鼠能量消耗(EE)与体重的散点图，如(A)所示。G 通过激光束穿过三个物理维度(SumXYZ)评估小鼠在不同日相的体力活动，如(a)所示。H 小鼠血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平如(A)所示。i I空腹胰岛素敏感性指数(ISI(F))，如(A)。
图2 膳食必需氨基酸的限制独立于非必需氨基酸或碳水化合物的供应，决定了系统对膳食蛋白质稀释的代谢反应
A 肝脏门静脉氨基酸水平在饮食适应一周后重新喂养低蛋白饮食时的反应。数据表示为饲喂正常蛋白饮食(20%P)的对照组的比例。N=5只/组，取自小鼠个体样本。数据分析采用学生t检验。不同于20%P，*P<0.05。B 肝组织氨基酸水平在饮食适应一周后重新喂养低蛋白饮食时的反应。数据表示为喂食正常蛋白质饮食(20%P)的对照组的比例。N=5只/组，取自小鼠个体样本。数据分析采用学生t检验。不同于20%P，*P<0.05。C实验组的营养源分解占总能量的百分比。EAA：必需氨基酸。NEAA：非必需氨基酸。D 根据(C)中含有营养能量来源的SF1A方案进行为期3周的饮食治疗后，小鼠的尿素排出量。N=5只/组，数据分析采用单因素方差分析和Holm-Sidak poc-hoc检验。与20P不同：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。与5P不同：#P<0.05，##P<0.0 1，###P<0.001。F小鼠的能量消耗，如D所示。G 小鼠血清成纤维细胞生长因子21水平同D。H 小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验(IpGTT)时的血糖水平，如(D)所示。I 小鼠腹腔葡萄糖耐量试验(IpGTT)期间的血浆胰岛素水平，如(D)所示。J 小鼠空腹胰岛素敏感性指数(ISI(F))。
2. 对Thr和Trp的限制是DPD效应所必需的
在跟进过程中，随后设法确定是哪一个特定的EAA能可以根据已知的生化特征赋予这些效应和选定的亚群。具体地说，根据它们的分类选择了一个亚群，这些亚群不能由哺乳动物代谢网络中的任何可能的前体合成，将这些EAA重新添加到低EAA饮食中，值得注意的是，只有严格新陈代谢必需的AA，即赖氨酸、苏氨酸和色氨酸，才是赋予全身代谢效应到完全剥夺EAA所必需的（图3a-d）。为了研究这些EAA中的一种是否可以赋予膳食EAA限制(DEAR)的效果，分别在EAA限制的饮食中添加了Lys、Thr或Trp，并可以证明这些单独的一种都不是DEAR的效果所必需的。根据逻辑推演，这意味着至少有两个，或者可能是所有三个EAA的限制，才能充分发挥DEAR的作用。为了初步测试这一点，将Lys、Thr或Trp限制在与完全氨基酸限制中发现的相匹配的水平，并可以证明剥夺Thr或Trp，而不是Lys，足以模拟DEAR的效果（图3e-h）。重要的是，这一发现在单独的实验中得到了证实，并且蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸含量低的膳食导致喂养效率低下，并增加了血清FGF21，类似于DPD。
图3 某些必需的氨基酸，包括苏氨酸和色氨酸，对于食物蛋白质稀释的系统代谢效应是充分和必要的
A 小鼠饲料效率的反应3周的饲料含有18%的氨基酸(正常氨基酸；NAA)，4.5%的必需氨基酸(LEAA；如图2C中的饲料E)，和LEAA添加赖氨酸，苏氨酸和色氨酸(LEAA+KTW)，苯丙氨酸，组氨酸和蛋氨酸(LEAA+FHM)，或异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸(LEAA+ILV)，所有与其他AA平均调整，以提供18%的AA总量。实验数据为Mean±SEM(n=6只/组)。数据分析采用单因素方差分析和Holm-Sidak-post-hoc检验。与日粮NAA不同的是：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。与膳食LEAA不同的是：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。B老鼠的能量消耗，如(A)项所示。C小鼠血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平，如(A)所示。D小鼠空腹胰岛素敏感性指数(ISI(F))，如(A)。E 用含有18%氨基酸(AA；NAA)、4.5%必需氨基酸(LEAA；如图2C中的饲料E)的饲料，以及单独限制赖氨酸(LK)、苏氨酸(LT)和色氨酸(LW)的饲料，以及与其他AA进行同等调整的饲料，对小鼠的饲料效率进行了3周的处理，所有其他AA都进行了同等调整，总共提供了18%的AA。数据均为Mean±SEM，n=6只/组。数据分析采用单因素方差分析和Holm-Sidakpost-hoc检验。与日粮NAA不同的是：*P<0.005，**P<0.01，***P<0.001。与膳食LEAA不同的是：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。F小鼠的能量消耗，如(E)。G小鼠血清FGF21水平，如(E)。H 小鼠的H ISI(F)，如(E)。I 用含有18%氨基酸(正常氨基酸；NAA)、4.5%AA(LAA；如图2C中的日粮B)和LAA添加苏氨酸和色氨酸，同时将总AA保持在4.5%(LAA(TW))的饲料，对小鼠进行为期3周的饲料效率试验。实验数据为Mean±SEM(n=5只/组)。数据分析采用单因素方差分析和Holm-Sidakpost-hoc检验。与NAA不同：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。与乳酸脱氢酶不同：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。J小鼠的能量消耗，如(E)。K小鼠血清FGF21水平与(E)相同。L如(E)中的小鼠的ISI(F)。
为了测试缺失这两个EAA对DEAR的影响的必要性，在AA总供应量较低的背景下进行了这两个EAA的选择性添加研究，并可以证明缺失Thr和Trp都是DEAR的系统代谢效应所必需的(图3I-l)。综上所述，在总蛋白/氨基酸同时限制的背景下，需要低水平的Thr和Trp才能达到全部效果，而单独限制Thr或Trp可以模拟DPD的大部分效果。之前的研究是在8周大的雄性小鼠身上进行的，这可能会限制本研究发现的适用性，因为众所周知，雌性小鼠对饮食挑战的反应不同，而且这些年轻小鼠仍在生长，因此，在6个月大的雄性和雌性小鼠身上测试了几种以前使用的饮食，测试了更长的时间框架(即8周)，以评估潜在的差异(图4)。此外，还测试了饲料氨基酸总量限制(LAA)，以及EAA(LEAA)和苏氨酸(LT)限制与氨基酸总量供应相匹配对体成分、代谢效率和代谢健康指数等各项参数的影响。值得注意的是，虽然LAA和LEAA导致体重减轻或体重稳定(图4A，b)，但主要反映为瘦质量损失，LT没有瘦质量损失，这反映在终点组织重量上，骨骼肌和心脏重量显示出与MRI测量的瘦质量相似的趋势(图4C，d)。关于肥胖，所有饮食的小鼠都增加了脂肪量，但MRI评估的饮食之间没有统计上的显著差异，除了接受LT的雄性(图4A，b)。然而，当评估单个脂肪组织储存库时，受AA/EAA饮食限制的雄性小鼠的肾上腺周围和皮下脂肪储存量都较低，但雌性小鼠的皮下脂肪储存量不低(图4C，d)。关于饲料效率，反应与体重变化相似，限制饲粮AA/EAA促进饲料效率持续降低，而不分性别(图4e，f)。然而，LT饲料比其他氨基酸限制组产生了持续更高的饲料效率(图4e，f)，这可能是因为对瘦肉质量的影响不那么明显，因为在所有受到AA/EAA限制的组中，无论性别，EE(图4G，h)和食物E摄入量都有同等的增加。与食物E摄入量和EE反应类似，AA/EAA限制的小鼠血清FGF21水平同样较高，与性别无关(图4I，j)，葡萄糖代谢方面从禁食的血糖和血浆胰岛素水平也表现出类似的结果，具有同样高的胰岛素敏感指数(图4K，l)。
由于DPD也影响脂质代谢和IGF1轴，限制饮食AA/EAA的血清甘油三酯水平较低，这在雄性小鼠中比雌性小鼠更明显，血清IGF1水平在完全限制氨基酸的情况下显著降低，但在限制饮食Thr的情况下不显著，限制饮食EAA会产生中间反应，特别是在雄性小鼠中。
图4 成年雄性和雌性小鼠对膳食AA限制的系统代谢反应是保守的。A 6个月大的雄性(如图2C所示)的身体、脂肪和瘦肉质量的变化响应于8周的处理，饮食中含有18%的氨基酸(正常氨基酸；NAA)，4.5%的AA(LAA；如图2C中的饮食B)，4.5%的必需AA(LEAA；如图2C中的饮食E)，以及苏氨酸含量低但总AA与NAA(LT)相匹配的饮食。实验数据为Mean±SEM(n=5只/组)。数据分析采用单因素方差分析和Holm-Sidakpost-hoc检验。与NAA不同：aP<0.05，aaP<0.0 1，aaaP<0.001。与LAA不同：bp<0.05，bbp<0.0 1，bbbp<0.001。与LEAA不同：CP<0.05，CCP<0.0 1，CCCP<0.001。B如(A)所示，6月龄雌性(左图)小鼠的身体、脂肪和瘦体重的变化。C治疗结束时小鼠的组织重量，如(A)所示。D治疗结束时小鼠的组织重量，如(B)所示。E小鼠在8周治疗期间的饲料效率，如(A)所示。F小鼠8周治疗期间的饲料效率，如(B)所示。小鼠的能量消耗，如(A)所示。H小鼠的能量消耗，如(B)所述。小鼠血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平如(A)所示。J小鼠血清FGF21如(B)所示。小鼠空腹胰岛素敏感性指数(ISI(F))，如(A)。LISI(F)，如(B)所示。
为了更进步一证实这一发现，即只有特定的EAA，如Thr和Trp对限制饮食EAA的影响是重要的，随后想要确认这些EAA在其他情况下的重要性。为此，本研究利用了一种肠道和肾脏中性氨基酸转运缺陷的小鼠模型(即B0AT1/slc6a19基因敲除小鼠)，该模型表现出类似于饮食蛋白质/氨基酸限制的代谢特征。最初，描述了肝门静脉氨基酸谱的特征，并可以证明虽然某些氨基酸水平较高，如Arg和Lys，但Thr和Trp水平明显较低(图5A)。为了测试这些氨基酸与这些小鼠表型的关系，进行了一项急性AA加回研究，可以证明系统性的加回(通过腹腔给药）Thr和Trp，但不是His和Phe可以逆转这些小鼠血浆FGF21水平的上调(图5B)，表明这两种EAA在应对膳食氨基酸限制方面的重要性。
图5 苏氨酸限制是其他全身性AA限制模型的共同特征，可以延缓肥胖诱导的小鼠代谢功能障碍
A 在标准对照饲料中，SLC6a19基因敲除(−/−)或野生型(+/+)肝门静脉血清氨基酸(AA)浓度。数据均为Mean±SEM，n=5只小鼠/组。数据分析采用学生t检验。不同于+/+：*P<0.05。B BSLC6a19基因敲除(−/−)或野生型(+/+)产仔小鼠在标准对照饲料中腹腔注射氨基酸苏氨酸和色氨酸(TW)、苯丙氨酸和组氨酸(FH)或溶剂(VEH：生理盐水)后，血浆FGF21水平。数据均为Mean±SEM，n=5只/组。数据分析采用双向重复测量方差分析。与+/+不同：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。与维持性血液透析不同：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。C 新西兰肥胖小鼠在为期4周的治疗期间，喂食含有18%氨基酸(正常氨基酸；NAA)的饲料，或者喂食苏氨酸含量较低但总氨基酸与NAA(LT)相匹配的饮食，可以降低血糖水平。数据均为Mean±SEM，n=8只/组。资料采用单因素方差分析进行重复测量。与NAA不同：*P<0.05，**P<0.0 1，***P<0.001。D小鼠在治疗结束时的血清甘油三酯(TG)水平，如(C)所示。数据分析采用学生t检验。与NAA不同：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。E治疗结束时小鼠血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平如(C)所示。
3. 限制Thr通过肝脏FGF21促进代谢健康
之前研究已经证明饮食蛋白质或氨基酸稀释可以延缓肥胖相关代谢功能障碍的发展，作者测试了选择性Thr限制(LT)在没有氨基酸总量限制或改变饮食碳水化合物供应的情况下，是否可以在肥胖相关代谢功能障碍的小鼠模型-新西兰肥胖(NZO)小鼠中模拟这些影响。值得注意的是，与之前对NZO小鼠进行蛋白质/氨基酸稀释的研究结果相似，LT对体重发育以及肝脏和脂肪组织重量没有影响。然而，在这个模型中，LT完全延缓了高血糖的发展(图5C)，降低了高甘油三酯血症(图5D)，并提高了血清FGF21水平(图5E)。总之，这些结果强调了饮食Thr是饮食AA限制在小鼠模型中常见的EAA介导效应，饮食Thr限制可以影响肥胖的积极健康结果。
因为FGF21通常受到膳食EAA限制的影响(图2-5)，而来自肝脏的FGF21传递代谢DPD和蛋氨酸限制的重塑。因此，用腺相关病毒表达Cre重组酶(AAV-Cre)给FGF21系小鼠，以肝/肝细胞特异性的方式沉默FGF21的表达/分泌，得出AAV-Cre治疗组血清FGF21水平缺失(图6A)。肝细胞FGF21沉默延缓了LT(图6B)降低的饲料效率，主要是由于LT完全消除了对体重增加的影响，对脂肪组织的影响减弱。此外，LT增加能量消耗(图6C)和食物能量摄入的效果也因肝脏FGF21沉默而被消除。与LT一致的是，LT改善了葡萄糖代谢(图6d)和降低了血清甘油三酯水平，同时也消除了肝/肝细胞FGF21的缺失。综上所述，LT的系统代谢重构需要肝源性FGF21。
图6 肝源性成纤维细胞生长因子21在限制膳食苏氨酸的系统代谢重构中是必需的
A Fgf21f1/f1小鼠在8周治疗结束时血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平：饲喂含18%氨基酸(AA；NAA)或低苏氨酸的饲料，与其他氨基酸等比例调整为总共18%的氨基酸(LT)；用腺相关病毒预处理，以肝细胞选择性的方式表达Cre重组酶(AAV-Cre)或绿色荧光蛋白(AAVGFP)，观察Fgf21f1/fl小鼠血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平的变化，结果表明，Fgf21f1/fl小鼠血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平高于Fgf21f1/fl小鼠。数据为Mean±SEM(n=6 NAA×AAV-GFP；n=7 LAA AAV-GFP；n=6 LT×AAV-Cre；n=8 L T×AAV-Cre)。数据分析采用双因素方差分析和Holm-Sidakpost-hoc检验。与NAA不同：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。与甲型肝炎病毒-绿色荧光蛋白不同：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。B小鼠在8周治疗期间的饲料效率，如(A)所示。C小鼠的能量消耗，如(A)所示。D小鼠空腹胰岛素敏感性指数(ISI(F))，如(A)。
4. 增强肝脏苏氨酸生物合成逆转苏氨酸限制效应
尽管EAA系统代谢周转与全基因组外显子组EAA丰度密切相关，但EAA的主要代谢命运可能不是蛋白质合成。因此，本研究试图验证是否无法合成严格的EAA，从而将其表征为DEAR效果的最大局限性和要求。为此，制备了腺相关病毒，以在小鼠肝细胞中表达酵母Thr生物合成酶(即Thr1和Thr4)，并对其进行LT。利用高分辨率质谱，在高表达THR1和THR4的小鼠肝提取物中鉴定出酵母蛋白THR1和THR4，但在那些表达GFP的小鼠肝提取物中没有鉴定出酵母蛋白THR1和THR4，qPCR也证实了肝脏特异性表达。重要的是，肝脏苏氨酸浓度的降低可以通过肝脏特异性的新苏氨酸生物合成的实施而逆转。令人惊讶的是，通过人为增加肝脏苏氨酸从头合成，限制膳食苏氨酸对代谢效率、血清FGF21和葡萄糖代谢的影响被完全逆转(图7A-D)。
图7 增强肝脏苏氨酸生物合成能力逆转系统对膳食苏氨酸限制的代谢效应
A 在用腺相关病毒转导肝脏表达酵母苏氨酸生物合成酶(AAV-yTHR1+THR4)或阴性对照(AAV-yTHR1+THR4)之后，用含有18%氨基酸的日粮(正常氨基酸；NAA；黄条)和限制苏氨酸含量的日粮(LT；绿条)进行为期3周的处理，可以显著提高小鼠的饲料效率。数据为mean±SEM(N=6只/组)。数据分析采用双因素方差分析和Holm-Sidak post-hoc检验。与日粮NAA不同的是：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。与甲型肝炎病毒-绿色荧光蛋白不同：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。B 如(A)项所述，老鼠的能量消耗。C小鼠血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平，如(A)所示。D小鼠空腹胰岛素敏感性指数(ISI(F))，如(A)。
讨论
DPD通过诱导肝细胞因子成纤维细胞生长因子21(FGF21)促进代谢健康，但是驱动这种反应的营养成分还没有完全定义。特别是，为了保持总热量供应的中性，这是饮食-表型交互作用中的一个重要考虑因素，必须同时增加另一种常量营养素来源。在以前的研究中，这通常是通过增加膳食碳水化合物来实现的，可能是FGF21增加的独立驱动因素，DPD也可以增加食物的摄入量，特别是在低蛋白质-高碳水化合物的饮食中，这种增加的食物摄入量被能量消耗的增加超过，从而促进了全身代谢效率低下的情况。然而，在低蛋白-高脂肪饮食中，小鼠体重增加了，这可能会促进代谢健康恶化，也可能不是。这种对DPD中不同稀释营养素的较弱反应可能是由于脂质与蛋白质或碳水化合物相比没有相对较弱的饱腹感，然而，配对喂养研究表明，DPD驱动的能量消耗增加和FGF21可以从食物摄入量中分离出来，这表明代谢效率低下的主要驱动因素不是食物能量摄取。
重要的是，本研究(图1-7)以及先前对氨基酸限制的研究已经得出结论，限制饮食蛋白质/氨基酸本身可以诱导系统对DPD的代谢反应，即使在总膳食氨基酸含量保持不变时(图1-7)，总蛋白N的供应和氧化也不会受影响(图2D)，但总能量和N摄入量之间有重要的关系，在这种情况下，对某些氨基酸和FGF21的作用进行解读是很值得的。另一方面，即使作为一种营养的饮食蛋白质可以被消化和吸收，本研究数据也强调了在饮食蛋白质限制的条件下，饮食氨基酸的供应是最重要的。重要的是，对slc6a19基因缺失小鼠餐后血浆氨基酸水平的代谢组学研究模拟DPD的影响，也显示了喂食标准实验室食物对苏氨酸和色氨酸的显著影响。相反，消融肠肽转运并不能模仿DPD的效果。
那么，对某些氨基酸的限制能带来这种反应吗？有几项研究表明，限制饮食中的EAA足以诱导对DPD的许多反应；另一方面，有几条证据表明限制肝脏的全身性非必需氨基酸(NEAA)供应会影响成纤维细胞生长因子21(Fgf21)和全身性新陈代谢。因此，有证据表明EAA和NEAA供应(即肝门静脉)和肝脏EAA和NEAA水平都受到DPD的影响(图2)，试图系统地研究EAA和NEAA限制的作用。通过一系列的研究确定EAA，特别是EAA、Thr和Trp是诱导对DPD的全身代谢反应的必要条件和充分条件(图2-7)，独立于总的膳食氨基酸供应。重要的是，这证实了先前的一项研究，预测苏氨酸是酪蛋白饮食下氨基酸外显子匹配的最有限的氨基酸，以及最近的一项研究表明，饮食酪蛋白/氨基酸限制引起的吞噬亢进与Thr和/或Trp的供应有关。然而，在这里,通过饮食氨基酸限制和使用氨基酸运输缺陷的遗传模型，证明了Thr和Trp在基于酪蛋白的饮食中都是同样有限的(图5)。虽然这似乎与那些研究相反，这些研究表明限制某些EAA，如支链AA(BCAA)或含硫AA(SCAA)足以模拟系统对DPD的代谢反应，这可能是由饮食供应和身体需求比率决定的滴定阈值所决定的。特别是，关于滴定，基于以5%E酪蛋白缺失确定了这种天然蛋白质来源中限制最多的氨基酸，如果还将氨基酸限制在理论水平以下，根据某些躯体约束，那么可能会引发类似的反应。事实上，尽管赖氨酸在牛奶蛋白酪蛋白中是一种丰富的氨基酸，但它是从玉米中提取的蛋白质中最有限的EAA，而且在促进健康的素食饮食中，许多EAA的饮食供应都会减少。尽管如此，已知某些EAA可以通过前体的新陈代谢来合成/释放，这些前体可以在体内动员和/或通过饮食供应。具体地说，限制EAA Met的系统反应可以通过饮食Cys驱动的Met节制来缓解，此外，对所有三种支链氨基酸的限制，而不是仅对亮氨酸的限制，概括了总氨基酸限制的许多特征。支链氨基酸之间的这种代谢补偿可能是由于三种支链氨基酸的代谢是由单一的转氨酶反应与支链氨基酸在体内的快速代谢联系在一起的，其中肝脏是主要的贡献者，尽管肝细胞中没有支链氨基酸转氨酶。因此，无论是在组织内还是在组织间，假设如果其中一个支链氨基酸受限，它可以被其他支链氨基酸及其新陈代谢所保护。为了支持“新陈代谢节制”的概念，对Thr从头合成的肝脏整修减轻了限制饮食Thr的影响(图7)，所以认为严格代谢的EAA，即Lys、Thr和Trp，在特定饮食中具有最大的限制潜力。然而，氨基酸限制敏感性的差异需要对营养EAA滴定进行仔细的研究，特别是研究完全基于单一营养来源(即牛奶蛋白酪蛋白)的AA供应的情况下。此外，还需要进一步的研究来仔细剖析在DPD期间哪些EAA驱动(不良)适应过程，特别是在躯体AA代谢改变的情况下，如年龄相关的疾病、感染或妊娠。由于本研究是在小鼠身上进行的，如果没有使用人类进行仔细控制的营养氨基酸滴定实验，本研究发现与人类营养反应的相关性是模糊的。
大部分研究都是使用年轻的母鼠喂养一段时间，这可能限制研究结果的实用性，特别是在不同于饮食的情况下，如生长/成熟阶段和成年阶段，氨基酸的需要可能不同。然而，在幼鼠中看到的限制饮食氨基酸的大部分影响(即饲料效率、能量消耗、食物摄入量、葡萄糖代谢)也反映在老年雄性和雌性小鼠中，尽管雌性小鼠的反应程度较小(图4)。值得注意的是，不同的氨基酸限制饮食对瘦体质量和骨骼/心肌质量的影响，总氨基酸或EAA限制降低了瘦肉组织质量，而低Thr饮食则没有。这突出表明，低Thr饮食可以诱导饮食氨基酸限制的许多影响，同时避免一些负面影响，如瘦组织浪费。在这一点上，类似于之前显示的饮食蛋白/氨基酸稀释，以及SCAA或BCAA限制，低Thr喂养也延缓了肥胖诱导的代谢功能障碍在小鼠模型中的发展(图5)。因此，限制饮食Thr可能是一种有吸引力的策略，可以模拟DPD的效果，而不会出现不必要的结果，特别是在饮食Thr主要由肠道代谢的情况下，因此可以避免许多潜在的不良全身副作用。
一些研究表明，全身性或肝脏限制的Fgf21丢失延缓了限制膳食蛋白/氨基酸的下游代谢效应。具体地说，这些效应可能是由中枢神经系统FGF21信号介导的，以刺激脂肪组织和心脏的营养吸收/氧化。这些研究结果表明，成人肝脏特异性FGF21的缺失完全消除了限制饮食Thr的系统代谢重构(图6)。此外，鉴于肝/肝细胞特异性恢复EAA生物合成可以挽救EAA限制的效果(图7)，即肝脏是“感知”饮食蛋白质/AA限制的主要解剖位置，鉴于其最接近营养吸收的解剖位置，这是合乎逻辑的。总之，通过对使用酪蛋白饮食的小鼠的研究，EAA的限制，特别是Thr和Trp的限制，对于赋予DPD的全身代谢效应是充分和必要的。