科研 | Curr. Biol.：蛋白质在真菌生物矿化纳米碳酸铜中的作用
编译：晨晨，编辑：Tracy、江舜尧。
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生物矿化在微生物对金属和其他元素的生物地球化学循环中起重要作用，一些研究强调了生物矿化合成纳米粒子的潜在应用。尽管在矿物界，蛋白质和纳米粒子的相互作用引起了人们极大研究兴趣，蛋白质在微生物对金属的转化和生物矿化中所起的作用仍没有被深入的和研究。在本篇文章中，研究人员使用富含碳酸盐的真菌培养液无细胞上清液阐明了真菌蛋白质参与碳酸铜纳米颗粒(CuNPs)的形成，他们使用蛋白质组学分析了培养上清液中的主要蛋白质，其中，磷酸丙糖异构酶(TPI)对CuNPs有很强的亲和力，并进一步研究了纯化的TPI对CuNPs形成的影响。他们还联合使用扫描电子显微镜(SEM)和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)证实了TPI在控制纳米材料的形貌结构中起重要的作用，使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)检测了蛋白质的构象变化，进一步阐明了蛋白质在生物矿化过程中与CuNPs的相互作用机制。该分析揭示了矿物表面蛋白质的去折叠和蛋白质结构β折叠片的增加，这些结果扩展了对微生物系统通过蛋白质分泌影响生物矿物形成的理解，该机制涉及复杂的蛋白质/无机系统的形成，并为无机-蛋白质纳米材料的合成提供了有用的指导。
论文ID
实验设计
实验结果
1.鉴定N.crassa产生的蛋白质
前期研究表明，粗糙脉孢菌的无细胞培养液中含氨基水解酶(脲酶)水解尿素释放的碳酸根离子，可溶性金属离子溶液与该培养液混合后产生金属碳酸盐矿物沉淀：
我们将20 mM CuCl2与N. crassa无细胞上清液混合后生成碳酸铜绿色颗粒沉淀，溶液中的蛋白质减少了90%。SDS-PAGE分析表明减少的蛋白与上清液中的蛋白完全一致，说明在生物矿中含有真菌分泌的蛋白。生物矿化后，上清液中的蛋白质含量急剧下降，分子量约为15、20和70 kDa的蛋白质仅剩下几条条带；真菌培养液上清液中的蛋白质分布在整个分子量范围内，代表整个蛋白质组，因此，下文的研究目标是鉴定参与碳酸铜纳米粒子生物矿化的蛋白质。
质谱分析结果表明在N.crassa生长培养基中有42种蛋白质（表1），它们参与多种代谢过程如碳水化合物代谢、应激反应和过氧化氢的去除。葡萄糖是培养基中的唯一碳源，因此我们检测到大量参与糖酵解的蛋白质；生长12天后，老化菌丝自溶导致细胞壁、细胞膜和细胞器的破坏，细胞质和线粒体中产生的蛋白质释放到细胞外环境中。碳酸铜NP沉淀后，上清液中仅检测到12种蛋白质，蛋白质的减少可能是因为一些蛋白质结合到NP中。许多蛋白质需要金属辅因子，包括铜、锌、镁、锰、铁、钴等，而蛋白质与铜纳米粒子之间的作用力可能是静电引力，真菌生长上清液中的蛋白质的等电点通常在pH5-7之间，低于反应pH值8.5，表明在形成碳酸铜的反应中大多数蛋白质带负电荷，利于生物矿中铜离子结合。
表1 在N.crassa生长培养基中检测到的蛋白质
2．与CuNPs相关的蛋白
为了鉴定NPs的特异蛋白，我们用浓度逐渐增高的SDS溶液洗涤生物矿化产生的CuNPs，洗涤后仍结合在矿物质上的蛋白质通过三氯乙酸(TCA)溶液混合进行沉淀，并进行SDS-PAGE电泳。我们用变性溶液洗涤时发现，结合松散的蛋白质从纳米粒子上去除，亲和力相对较高的蛋白质仍与纳米粒子结合(图1)，然后他们通过ImageJ计算各个条带的相对强度对单个蛋白质条带进行定量，较暗的条带表示较高的相对密度。在10%的SDS中煮沸30分钟后，一些蛋白质仍然与矿物质结合在一起，表明蛋白质与蛋白质之间有很强的相互作用。蛋白条带A-G如图1B所示，与其他条带相比，分子量为25 kDa的条带显示出最高的密度，通过质谱鉴定的结果见图1插入的表格。
我们检测到7种不同的蛋白质，如烯醇酶、磷酸丙糖异构酶(TPI)和葡糖淀粉酶，其中，TPI的分子量为27，388 Da，相对含量最高，具有最高的蛋白质丰度修饰指数(emPAI)，而在25 kDa凝胶带中存在一些蛋白质，如热休克蛋白hsp98，但它们不存在于完整的蛋白质组中，可能是因为这种蛋白质在真菌的完整蛋白质组的相对浓度太低，但在矿物结构中富集后的相对丰度增加。
通过扫描电镜，我们观察10% SDS中洗涤30分钟后的矿物形态(图1C和1D)。与碳酸铜NPs的均质颗粒和粉末状结构相比，洗涤后发现一些大小约为400-500纳米的颗粒聚集体，纳米粒子具有较高的表面积与体积比，总自由能趋于降低导致粒子团聚，一些蛋白质可以通过增加纳米粒子间的相互作用力来稳定溶液中分散的纳米粒子，因此，用10%SDS去除生物纳米粒子中的蛋白质导致纳米粒子的聚集。
图1 N. crassa产生的蛋白质与CuNPs相关
(A)从无磷酸盐的AP1培养基中沉淀的碳酸铜12% SDS-PAGE:(1)细胞培养基上清液，(2)未经任何预处理的NPs，(3)用100 mM Tris-Cl处理的NPs，(4) Triton X-100处理的NPs，(5) 2%SDS处理的NPs，(6) 10%SDS中煮沸10分钟后的NPs，和(7) 10%中煮沸10分钟的后NPs。(B)ImageJ计算凝胶带相对密度。(C)未经过任何预处理的CuNPs扫描电镜图像。(D) 10% SDS洗涤30分钟后的CuNPs扫描电镜图像。插入的表格为已鉴定的与CuNPs结合的蛋白质，以及每种蛋白质的离子评分、大小、emPAI(指数修饰的蛋白质丰度指数)和等电点。
3. TPI对CuNPs形态的影响
为了研究蛋白质与纳米粒子反应的机理，我们测试了单一蛋白质TPI对纳米矿物形成的影响，他们在大肠杆菌中克隆并表达了TPI，对TPI同源建模如图2。TPI与矿物质有很强的结合能力，反应体系中的大部分TPI通过矿物质沉淀去除。
我们进一步研究了TPI对碳酸铜形成的影响，并将生物矿与化学合成的碳酸铜进行了比较，他们通过混合20 mM (NH4)2CO3和2 mM/20mM CuCl2获得的碳酸铜为对照组，也设置了两种不同的铜浓度研究浓度对金属纳米粒子形成的影响，他们将终浓度为0.02和0.1 mg/mL的TPI加入到化学反应体系物中，反应pH约为8.0至8.1，然后他们收集矿物质沉淀，并通过SEM和CLSM检测揭示相关蛋白对矿物质形态的影响。
图2 N. crassa TPI蛋白质序列和二级结构预测
(A) N. crassa TPI氨基酸序列的二级结构预测，(B)利用SWISS-MODEL 对TPI同源性建模 (https://swissmodel.expasy.org/)。原始TPI蛋白中的α螺旋百分比为48.8%，β折叠为15.3%，β转角为9.7%。
反应24小时后，在20 mM (NH4)2CO3和2 mM氯化铜的混合物中我们发现少量结晶核 (图3A)，但在0.02mg/mL TPI的样品中没有观察到明显的晶体结构，样品表面被一干燥的有机材料薄层覆盖(图3B)。当TPI浓度增加到0.1 mg/mL时，有直径为60 nm颗粒沉淀出现。粒子系统的微环境影响纳米粒子的成核和生长，其中溶液化学、pH、温度以及生物分子是关键因素，蛋白质骨架中酰胺基团的氮原子和一些氨基酸残基可以与Cu2+形成复合物。蛋白质紧密结合在矿物结构中(图1C)。在晶体生长的早期阶段，这种生物分子结合到矿物表面，使得在“爆发成核”后碳酸铜颗粒表面上的生长位点被阻断，从而导致NPs的形成。在20 mM (NH4)2CO3和20 mM氯化铜的反应中(图3D-3F)，形成了由大量纳米晶体组成的微米级球形颗粒聚集体，与不含TPI或含0.02 g/L的TPI(图3D和3E)样品的形态相比，添加高浓度蛋白质(0.1mg/mL TPI)形成的颗粒更分散且聚集延缓；与对照组相比(图3G)，在2 mM氯化铜和0.1g/L TPI下观察到直径约100纳米的颗粒(图3I)。在反应早期形成的核蛋白复合物可以为结晶提供更多的成核位点，进一步促进核蛋白的形成；过量添加蛋白质会抑制或促进成核速率和晶体生长，决定核蛋白质的最终形态，增强纳米粒子的稳定性并防止粒子聚集。
这些结果表明TPI在生物矿化中发挥重要作用。为了比较不同蛋白质对碳酸铜纳米粒子形态的影响，我们使用牛血清白蛋白(BSA)和超氧化物氧化酶(SOD)作为阳性对照，后者具有与TPI相似的分子量(27，804 Da)。20 mM (NH4)2CO3、2 mM CuCl2和0.1mg/mL蛋白质反应14天后，形成球形颗粒聚集体，我们没有观察到单个纳米粒子。TPI与碳水化合物有强大亲和力，在TPI存在下产生的蛋白质都在纳米级范围内，因此，不同的蛋白质大小和结构形成不同的铜-蛋白质复合物，影响矿物的晶体发育和形态。当[Cu2+]为20 mM时，没有稳定纳米粒子的生成，表明真菌生长上清液形成的纳米粒子可能是几种蛋白质的综合作用，甚至受其他生物分子如氨基酸和多糖的影响。
图3 添加TPI后形成的碳酸铜矿物扫描电镜图像
(A–C)该矿物由20 mM (NH4)2CO3、2 mM CuCl2、分别在不添加和添加0.02和0.1 mg/mL TPI的情况下产生，反应时间为1天；(D–F) 该矿物由20 mM (NH4)2CO3、20 mM CuCl2、分别在不添加和添加0.02和0.1 mg/mL TPI的情况下产生，反应时间为1天；(G–I) 该矿物由20 mM (NH4)2CO3、2 mM CuCl2、分别在不添加和添加0.02和0.1 mg/mL TPI的情况下产生，反应时间为14天；(J–L) 该矿物由20 mM (NH4)2CO3、20 mM CuCl2、分别在不添加和添加0.02和0.1 mg/mL TPI的情况下产生，反应时间为14天。
为了研究矿物质和蛋白质的空间关系，我们使用CLSM研究了20 mM (NH4)2CO3、2 mM CuCl2和0.1mg/mLTPI反应生成的矿物质。CLSM能够揭示生物样品中金属和生物大分子的分布，但很少用于地球微生物学的研究，图4说明了蛋白质(红色)和铜(绿色)的相互作用。CLSM图像显示了覆盖在矿物表面和矿物簇内部的蛋白质的强信号，表明可能有多层蛋白质吸附在矿物表面上；共定位分析评估了蛋白质和铜的信号，铜通道的曼德尔系数(MCu= 0.948)远高于蛋白质通道(Mprotein= 0.788)且接近1，表明铜与蛋白质共定位，也说明了蛋白质在铜矿物的形成中起主要作用。在铜作为NP-蛋白质复合物的初始核形成之后，矿物质前体可以随后与更多的蛋白质相互作用，导致蛋白质和CuNPs基质的形成。
图4 TPI和铜矿物之间相互作用的共聚焦图
(A)在样品中以5 um间隔拍摄的蛋白质-矿物聚集体的2D图像。样品由20 mM (NH4)2CO3、2 mM CuCl2、0.1mg/mL TPI生成，反应时间为14天。(B)由2D图像生成的3D数据集，可视化矿物的顶视图、侧视图和前视图，蛋白质以红色显示，铜以绿色显示。
4.FTIR分析蛋白质构象变化
FTIR进一步鉴定了铜矿物和蛋白质之间的相互作用及化学组成。我们比较了0.1g/L TPI存在下产生的矿物质与标准孔雀石(Cu2(OH)2CO3) (图5A)。孔雀石的FTIR分析显示了CO32-的特征峰，分别在约1，490和1，378 cm–1 (不对称拉伸)、1，041 cm–1 (对称拉伸)和816 cm–1 (弯曲模式)处。我们在约3，400 cm–1处观察到的宽带表示分子间键合的氧氢基团的拉伸振动，20 mM CuCl2和0.1 g/L TPI形成的生物矿与标准品有相似的模式，在1600-1700 cm–1附近出现了一个强带，是描述蛋白质结构中碳氧拉伸的特征酰胺带。蛋白质的酰胺二峰出现在1452 cm–1左右，酰胺基和羰基通过氢键的相互作用有可能使碳酸盐峰在1，490 cm–1或更高的波数(1，520 cm–1)。在富含蛋白质的环境中生产的样品也显示出其他蛋白质峰，例如酰胺ⅲ峰在1，240 cm–1，酰胺ⅳ峰在3，000-3，400 cm–1附近额外波动；此外，在2，960 cm–1附近峰的出现归因于碳-氢拉伸，这也说明了矿物结构中存在有机物。
FTIR能够确定蛋白质的二级结构，所以我们通过对酰胺I峰进行曲线拟合来研究构象变化(图5B和5C)。酰胺I峰可分解为a螺旋、β折叠片、β转角和无规卷曲：矿物中不同二级结构的百分比含量如图5所示。TPI的同源性建模显示TPI是一个富含螺旋和β桶结构的蛋白质，原始TPI中的a螺旋为48.8%，β折叠片为15.3%，β转角为9.7%。TPI蛋白具有疏水残基(如丙氨酸、缬氨酸)，而极性残基朝外，这使得大多数β-桶蛋白有高度亲水性。蛋白质掺入矿物结构后，α螺旋的含量有不同程度的降低：由2 mM氯化铜和0.1g/L TPI反应合成的矿物的α螺旋百分比为38.4%，但对于铜含量较高的样品(20 mM)，该值降低浓度至25.7%。2 mM CuCl2和0.1 g/L TPI反应生成的样品β折叠片含量增加至33.7%；对于由20mM CuCl2和0.1 g/L TPI生成的样品，β折叠片含量增加至23.4%(图5)。
几种矿物质与蛋白质的相互作用力，包括静电吸引、范德华作用力、氢键、溶剂分子的熵增或反离子释放，都会导致蛋白质构象变化。富含α-螺旋的亲水性蛋白质与NP相互作用，NP取代蛋白质表面的水分子，这一过程中氢键的重排导致螺旋结构和其他构象变化减少，具有亲水性的螺旋更容易附着在NP表面，这可以解释TPI与CuNPs的强亲和力，而α螺旋百分比的减少和β折叠片的增加表明与CuNPs相关联的TPI的去折叠。之前已经报道了不同蛋白质和NP表面的类似现象，在大多数情况下，α螺旋的减少被β结构的增加所抵消。2 mM CuCl2和0.1 g/L TPI合成的样品中β结构的增加可归因于蛋白质与蛋白质反应，即蛋白质分子的多层吸附或更多TPI分子附着到预先吸附的TPI上。据报道，蛋白质分子的组装导致矿物表面β结构水平的增加；Cu2+的不同初始浓度对吸附有TPI的NPs的二级结构有不同的影响，且更高浓度的Cu2+诱导更多的构象变化，表明金属浓度较高时，较大的表面积提供更多的蛋白质吸附位点，导致更高水平的构象变化。
这项工作确定了N. crassa生长过程中产生的蛋白质，并提供了这些蛋白质在生物矿化中的作用见解。我们利用蛋白质组学分析筛选出了与CuNPs有高亲和力结合的蛋白，并进一步详细研究了TPI对矿物质形成的影响，证明了NPs在TPI存在下广泛形成。SEM和CLSM实验揭示了金属离子与蛋白质在微米尺度上的空间关系，而我们用FTIR检测蛋白质的构象变化证实了与CuNPs互作的蛋白，蛋白质和金属纳米粒子之间的互作机制的理解可为NP的工业生产和优化提供方案。
图5 蛋白质与矿物质相互作用的ATR-FTIR分析
(A)碳酸铜标准品的FTIR光谱，以及分别在14天后在0.1mg/mL TPI存在下将2和20 mM CuCl2与20 mM (NH4)2CO3混合制备的矿物质。(B和C)背景减去蛋白质酰胺I带(1，600–1，700cm–1)的曲线拟合，用于二级结构测定。(B)和(C)分别通过将20 mM (NH4)2CO3和0.1 mg/mL TPI与2和20 mM CuCl2混合来制备。插入的表格表示根据峰面积计算的每个二级结构的相对比例(%)。