科研 | 国人佳作：不同的MicroRNA家族参与调节棉花（陆地棉）花药发育过程中的高温胁迫响应
编译：菜鸟菠萝，编辑：十九、江舜尧。
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microRNAs（miRNAs）是广泛参与响应植物非生物胁迫的小分子RNA。在常温和高温（分别为NT和HT）条件下，对棉花花药4个发育阶段的小RNA进行测序，研究miRNAs对高温的胁迫响应特性。共鉴定出77个miRNAs，包括33个已知miRNAs和44个新miRNAs，其中分别有41个和28个miRNAs在NT和HT条件下差异表达。在剔除NT条件下基因型特异性miRNAs后，在孢子细胞增殖（SCP）、减数分裂期（MP）、小孢子释放期（MRP）和花粉成熟期（PM）阶段分别鉴定了10个（包括12个miRNAs）、4个（包括6个miRNAs）、4个（包括5个miRNAs）和7个（包括11个miRNAs）在HT条件下响应的miRNA家族。7个miRNA家族（SCP期的miR2949、miR167和miR160；MP期的miR156和miR172；MRP期的miR156；PM期的miR393和miR3476）的表达丰度超过总表达丰度的10%，是响应HT胁迫的主要调节因子，具有正向或负向的调控模式。这些miRNAs调控相应靶基因的表达，导致耐高温品系和高温敏感品系的反应不同。结果表明，棉花花药中miRNAs对HT胁迫的响应具有阶段特异性，并随花药发育的不同而不同。研究结果有助于加深理解棉花花药中miRNAs对HT的胁迫响应，并有助于阐明植物对HT胁迫的耐性机制。
论文ID
原名：Different MicroRNA Families Involved in Regulating High Temperature Stress Response during Cotton (Gossypium hirsutum L.) Anther Development
译名：不同的MicroRNA家族参与调节棉花（陆地棉）花药发育过程中的高温胁迫响应
期刊：Int J Mol Sci (International Journal of Molecular Sciences)
IF：4.183
发表时间：2020年2月
通讯作者：朱生伟&刘志
通讯作者单位：中国科学院植物研究所植物分子生理学重点实验室，湖南农业大学生物科学与技术学院
DOI号：10.3390/ijms21041280
实验设计
结果
1. sRNA测序的全局分析
根据对测序结果的统计分析，平均定位率比在96％以上。与miRBase数据库进行比对，在四个花药发育阶段的所有样品中共鉴定出77个miRNAs，包括33个已知的miRNAs和44个新的miRNAs（7个新的miRNAs不能统一命名）。在花药发育早期检测到的miRNAs数量要多于后期（FigS5）。所有的70个miRNAs（33个已知的miRNAs和37个新的miRNAs）被分为41个miRNA家族。其中，有13个家族包含两个或更多成员，其余为单成员家族。miR482家族包含7个成员，随后是miR3476和miR156家族，每个家族包含5个成员。7个未命名的miRNAs属于7个陆地棉特有的miRNA家族，这表明在miRNAs高度同源的前提下也存在物种特异的miRNAs。
Fig S5 早期花药与后期花药miRNAs统计分析
2. 差异表达的miRNAs的鉴定和表达丰度分析
在常温（NT）条件下，总共68个miRNAs（44个上调和24个下调）差异表达（Fig1b）。在每个花药发育阶段HT胁迫下仅发现38种差异表达的miRNAs（21种上调和17种下调）（Fig1a）。分别在NT和HT条件下鉴定出41个和28个独特的差异表达miRNAs。根据表达水平，考虑到所有发育阶段，在HT胁迫下6、8和14个差异表达的miRNAs分别具有高，中和低丰度（Fig2a）。每个多成员家庭只有一个成员的丰度高（TPM≥500），而另一个成员的丰度低（TPM <500）（Fig2b）。
Fig1在常温（a）和高温（b）条件下差异表达的miRNAs的直方图。
Fig2在HT胁迫下花药发育的四个阶段，miRNAs的差异表达。
3. 在不同发育阶段响应HT应激的各种miRNA家族
去除NT条件下基因型特异性miRNAs后，通过高温处理的HT耐受和HT敏感系中差异表达的miRNAs的比较分析，获得了不同发育阶段的HT应激反应miRNA家族（Fig3）。SCP，MP，MRP和PM阶段分别具有10个（包括12个miRNAs），4个（包括6个miRNAs），4个（包括5个miRNAs）和7个（包括11个miRNAs）HT应激反应性miRNA家族（Fig3）。该结果表明，与其它三个阶段相比，SCP阶段对HT应激反应的miRNAs或miRNA家族更多。①在SCP阶段，在HT胁迫下miR172和miR2949家族在HT耐受和HT敏感品系中表现出明显的差异表达模式。HT耐受株系的花药中两个家族的高成员（ghr-miR172和ghr-miR2949a-5p）被下调，而其他家族成员显示相反的表达趋势。在HT胁迫后，耐高温株系中的单成员家族，即miR160，miR396，miR7495，miR4344和miR167被下调，而其它单成员家族miR156，miR482和miR3476被上调。②miR156家族在MP和MRP阶段对HT应激作出反应。在MP期，ghr-novel-miR156e-3p> ghr-novel-miR156f-3p和ghr-miR156a> ghr-miR156b> ghr-miR156d的表达趋势分别在MP阶段增加和减少。ghr-novel-miR156e-5p> ghr-novel-miR156f-5p在MRP阶段被HT胁迫显著诱导。ghr-novel-miR156g-3p的表达趋势在HT耐受株中被抑制。ghr-novel-miR156g-5p是MP和MRP阶段共有的差异表达的miRNA，在两个时期中显示相反的表达趋势。除miR2949外，其它家族（miR172，miR535，miR827和miR7486）在HT耐受株中均受到抑制，而miR2949在MP阶段被上调。③在PM阶段，miR3476，miR482和miR393家族的成员也表现出相反的趋势。HT胁迫诱导了耐HT系花药中的四个家族（miR394，miR156，miR7495和miR6960）。
在本研究中，7个miRNA家族（SCP阶段的miR2949，miR167和miR160；MP阶段的miR156和miR172；MRP阶段的miR156；PM阶段的miR393和miR3476）的表达丰度超过总表达量的10％，这是通过正调控模式或负调控模式响应HT压力的主要调控因子（Fig4a）。通过qRT-PCR证实了在HT胁迫下，这些miRNA家族成员在不同发育阶段的表达，并且表达趋势与小RNA测序的结果高度相似（Fig5）。
Fig3花药阶段在HT耐受和HT敏感株系中响应HT胁迫的特异miRNA家族
Fig4差异表达的miRNA家族表达丰度的热图和预测靶基因的KEGG富集分析
Fig5通过小RNA测序鉴定的主要HT反应性miRNAs的qRT-PCR验证
4. 靶基因预测和KEGG分析
使用处于不同发育阶段的主要HT应激反应性miRNA家族来预测靶基因，以了解miRNAs的可能生物学功能或机制途径。通过KEGG富集分析了功能和注释（Fig4b）。在SCP阶段，共有656个靶基因被注释到细胞周期，脂肪酸代谢和过氧化物酶中。KEGG富集结果表明，MP和MRP阶段分别有562和221个预测的靶基因集中在能量代谢上。在PM阶段，50个靶基因富集在细胞周期，植物激素信号转导和p53信号传导途径上。比对预测的目标基因与转录组测序数据，结果显示ARF6是miR167，miR160和miR949阶段的SCP靶基因。miR156靶基因SPL在MP和MRP阶段参与了HT应激反应。但miR156家族的三个成员显示出不同的表达模式。另外，在MP阶段，miR172被HT胁迫抑制。它的靶基因TOE1在耐HT系的花药中被显著诱导。PM阶段，在miR393家族中鉴定了靶基因TIR1和AFB，并在miR3476家族中鉴定了SurE。在Fig 6所示的示意图中总结了主要的HT胁迫反应性miRNA家族及其在不同花药发育阶段的靶基因。在HT胁迫下，已鉴定的HT应答性miRNAs（Fig5）靶向的19个预测基因的表达进一步增强。经qRT-PCR证实，这些靶基因的表达趋势（上调或下调）在转录组测序数据和qRT-PCR数据之间高度一致（Fig7）。
Fig6显示了不同的miRNA家族及其靶基因与花药发育不同阶段的HT胁迫引起的棉花雄性不育相关示意图
Fig7通过RT-PCR验证转录组测序鉴定的19个预测目标基因
讨论
1. 更多的miRNAs参与花药发育的早期
在该研究中，花药早期阶段有很多的miRNAs被检测到，表明可能发生了强有力的转录后调控，其中可能涉及核酸和蛋白质的合成以及减数分裂。这说明，花药发育的早期可能是miRNAs参与花药发育的调控的重要时期。
2. 在高温胁迫下高和低丰富度的miRNAs表达的不同变化
每个多成员家族均来自于HT胁迫下差异表达的miRNAs的家族分类，其中包含一个高丰度成员和一个或多个低丰度成员。这两种类型miRNAs的表达趋势在HT敏感和HT耐受品系中相反。同一家族中的miRNAs具有相似的功能，这归因于其保守的序列和结构构型。这两种miRNAs丰度的协调调节最终导致热应激反应的调节。
3. 不同的MiRNA家族在高温胁迫下对花药发育的时间和精细调控
在HT胁迫下HT敏感和HT耐受的品种中差异表达的miRNAs在家族分类中表现出阶段特异性。该发现表明花药发育的不同阶段受不同的miRNA家族调控。miR160，miR167和miR2949家族在高温胁迫下的SCP阶段表现出较高的丰度比表达。在MP和MRP时期，miR156家族的丰度很高。此外，miR172家族在MP时期表现出高丰度表达。miR156在花药发育的早期参与细胞分裂和分化调控。HT应激可显着诱导miRNA156，导致雄性不育。miR156在拟南芥中的过表达导致对环境温度敏感而开花。靶基因预测和功能富集分析表明，高丰度miRNA家族的靶基因在MP和MRP阶段参与能量代谢。可能是miR156和miR172家族的异常表达破坏了这种平衡，并最终导致敏感品系（TS18）表现出HT敏感性。在花药发育的最后阶段，miR393和miR3476家族同时显示出高度丰富的表达。miR393可以由多种非生物胁迫（例如HT或LT和干旱）诱导。但目前尚未报道miR3476家族的功能。功能富集结果表明，miR393和miR3476家族的靶基因参与细胞周期，植物激素信号转导和p53信号通路。
4. 高温胁迫下各种miRNA家族及其靶基因产生棉花雄性不育
miRNAs参与植物繁殖发育和非生物胁迫反应的调控。miR160和miR167通过其靶基因（ARF）对HT应激作出反应，这些靶基因与生长素信号传导途径有关。miR172可靶向类似AP2的基因，如TOE1，TOE2和SMZ，这些靶基因是花器官分化过程中的重要转录因子。HT胁迫可能通过调节miR172的表达影响了花药的发育。作为miR156的靶基因SPL对许多植物的花药发育和雄性育性至关重要。当SPL充当miR172的转录激活因子时，在HT胁迫下受到抑制导致AP2积累，从而与JAZ蛋白相互作用，JA的过量积累最终导致雄性不育。在PM阶段，HT胁迫抑制了HT敏感株系中TIR1和AFB的表达导致进了生长素的过度积累，最终可能导致雄性不育。
结论
综上所述，通过高通量测序技术，于高温的逆境条件下，在棉花花药不同发育阶段建立了sRNA文库。总共鉴定出77个miRNAs，包括33个已知的miRNAs和44个新的miRNAs。在NT和HT条件下分别总共表达41和28个miRNAs。除去NT条件下基因型特异性miRNAs的变化后，SCP，MP，MRP和PM阶段分别有10个（包括12个miRNAs），4个（包括6个miRNAs），4个（包括5个miRNAs）和7个（包括11个miRNAs）HT应激反应miRNA家族。在棉花花药发育四个阶段中，表达丰度超过总表达丰度的10％的7个miRNA家族，其是对HT胁迫产生正向或负向调控模式的主要和重要调控因子。该结果将增加对miRNAs在棉花花药中HT胁迫响应的理解。
评论
由于近几年全球温度不断升高，在夏季极易出现极端高温（HT）的天气，而这种高温与棉花开花期同时发生。因此，在这过程中容易影响棉花的生殖生长，进而影响作物产量。而miRNAs参与植物对非生物胁迫的反应，例如干旱，盐度，低温（HT）和高温，目前，据报道只有少数miRNAs参与棉花花药发育过程，本研究通过转录组分析miRNAs在花药发育过程的相关过程，结果显示，miR160，miR167和miR2949家族是处于孢子形成细胞增殖（SCP）阶段的主要HT应激反应家族。miR156和miR172家族在减数分裂阶段（MP）表现出高丰度比。由转录组数据预测靶基因，并通过结合mRNA-seq和小RNA-seq（sRNA）进一步建立了棉花花药发育过程中miRNAs介导的HT胁迫反应的模型。该结果可以帮助阐明棉花HT胁迫耐受性的机制。
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