科研 | Cancers：转录分析揭示结肠癌患者血液循环和肿瘤微环境中基因表达的系统性改变
编译：艾奥里亚，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Transcriptomic Analyses RevealedSystemic Alterations in Gene Expression in Circulation and TumorMicroenvironment of Colorectal Cancer Patients
译名：转录分析揭示结肠癌患者血液循环和肿瘤微环境中基因表达的系统性改变
期刊：Cancers
IF：6.162
发表时间：2019年12月
通讯作者：EyadElkord，Nehad M. Alajez
通讯作者单位：哈马德·本·哈里发大学（Hamad Bin Khalifa University）
DOI号：10.3390/cancers11121994
结果
1 CRC患者PBMCs转录组分析显示基因表达的系统性变化
对10例CRC患者和15例健康人的PBMCs进行了宏转录组RNA-seq分析。患者的特征见表1。基于2.0 fold change（FC）同时以p≤0.05以修正p值发现，共有上调260个转录本，下调508个转录本。
基于转录本的差异表达，对样本数据进行了对数折叠分层聚类分析，以揭示CRC与健康受试者的不同聚类（图1a）。在CRC患者的PBMCs中丰富了一系列细胞过程和功能类别（包括调节细胞过程，调节细胞凋亡，调节激酶活性，调节细胞分化，免疫反应，调节细胞增殖，积极调节代谢过程，对脂糖的反应和调节蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性）。此外，基于主成分分析，科研人员观察到类似的区别（图1b）。有趣的是，与健康受试者相比，CRC患者的PBMCs中观察到了不同的免疫反应簇。由BCL3，CCL2，CCL3，CCL4L1，CCL4L2，CCL7，CD83，CTSL1，CXCL2，CXCL3，DEFA1，DUSP4，EREG，GNL1，GPR183，HBEGF，IL10，IL1R1，IL1R2，IL1RAP，IL6，IL8，IRS2，JUN，NFIL3，NFKBIA，NLRP3，OASL，OSM，PDCD1，PELI1，PIK3R1，PNP，PTGER4，RGCC，RGS1，RIPK2，SEMA7A，THBS1，TNFAIP3，ULBP2以及VEGFA组成的免疫信号在CRC患者PBMCs中有所富集。另一方面，由AIM2，APOBEC3D，BLNK，BTK，BTN3A3，CARD9，CASP10，CCR2，CD180，CD19，CD36，CD79B，CIITA，CLEC4C，CMKLR1，CR2，CSF1R，CYBB，DDX58，HCK，HLA-DOB，IGSF6，LYST，MARCH1，MEF2C，MEFV，MS4A1，MSH2，NAIP，NLRC4，OAS1，OAS2，P2RX7，PAK1，POU2AF1，POU2F2，SAMHD1，ST6GAL1，TAP2，TLR10，TLR5，TLR7，TLR8，TNFAIP8L2，TNFSF10，TRGV3以及TRIM5组成的免疫信号在健康受试者中有所富集（图2a）。基于qRT-PCR技术验证了6种上调转录本（CXCL2、IL8、CCL7、CXCL3、IL0和CCL3）和6种下调转录本（TLR7、TLR5、TLR10、TLR8、tnfsf10和cd79b）的表达（图2b）。
2 CRC患者和健康受试者PBMCs中差异表达基因的下游效应分析
基于下游效应分析，研究者揭示了有关上述所提及的基因对细胞和功能过程贡献的更深入的了解。通路途径分析（Ingenuity pathway analysis，IPA）提供了与基因表达变化相关的改变功能类别的整体上的概述。基于RNA-seq数据，通过与健康受试者相比，图3a以系统分类热图形式描述了CRC患者PBMCs中受影响的功能类别。值得注意的是，在CRC患者的PBMCs中观察到富集的功能类群主要与免疫细胞转运和细胞运动相关（图3b-c）。另一方面，与细胞死亡和胃肠道疾病有关的功能类别在来自CRC患者的PBMCs中同样被发现（图3d-e）。
3 与健康受试者相比，机理网络分析预测了CRC患者PBMCs的多个改变信号网络
机理网络分析是预测CRC患者中观察到的转录组变化的有效方法，通过与健康供体进行相比，可以更好的探究如何对信号网络产生下游效应。基于IPA对差异表达基因的网络分析表明，有一些机理网络在CRC患者的PBMCs中有所富集，这其中包括TNF、IL1A以及CCL5。图4a强调了TNF的预测激活状态及其对几个具有很强置信度的下游分子的直接激活效应（ILLB，NFKB，RELA，NFKB1和P38MAPK），这些分子反过来又对STAT3、HIF1A和JUN等基因有进一步的下游激活作用，且都具有很高的可信度。这强调了TNF激活状态的级联效应及其在复杂网络中影响其他基因的能力，无论是直接的还是间接作用，都表现出很高的置信度。
如图4b所示，IL1A对p38MAPK、AP1、RELA和NFKB复合物具有激活作用，且具有较高的置信度，但对IFNG的激活作用却表现出具有较低的置信度。每个下游分子都会影响一些相同的包括PPA RG、JUN、SP1、NFKB、HIF1A、KLF6和STAT3等在内的重复发生基因。通过IL1A，IFNG被预测可以激活IRF1干扰素调节因子，并抑制STAT1，但表现出较低的置信区间。STAT1、STAT3、RELA、Ap1和SP1也被激活，或是在STAT1存在的情况下，CCL5通过间接影响IL4、ERK1/2和AKT，从而起到抑制作用（图4c）。
4 与邻近正常组织相比，CRC肿瘤组织的变化
为了更深入地了解CRC患者中的基因表达变化，基于RNA-seq和转录组对10个CRC患者病变组织和相邻正常组织进行了分析，根据差异表达的转录本作为样本进行对数折叠分层聚类，揭示了CRC患者病变组织和相邻正常组织的不同聚类（图5）。采用2.0fold change（FC）和p≤0.05修正p值，研究者发现共有634个上调基因以及991个下调基因。尽管仍有一个肿瘤样本与相邻正常组聚类在一起外，PCA分析揭示了CRC病变组织与相邻正常组织之间的显著区别（图5b）。在肿瘤组织（TT）和正常组织（NT）中观察到不同的富集细胞过程模式。在CRC患者中许多富集的细胞过程参与了细胞周期过程，如DNA复制、染色体分离、核小体组装、蛋白质异聚活性和细胞分裂。与NT相比，CRC患者中的病变组织中被抑制的功能类别主要包括生物粘附、钙离子结合、突触传递和细胞发育调控（图5a）。
5 CRC患者中多种改变的功能类别以及信号网络
基于RNA-seq数据，通过绘制高分辨率热图，发现与相邻正常组织相比CRC患者组织中功能类别的改变（图6a）。这些类别包括细胞运动、生长和增殖、DNA复制、重组和修复等（图6b-d）；而肿瘤组织中存在的功能类别主要和细胞凋亡相关（图6e）。进一步通过上游调控因子分析，其中的网络存在不同程度的激活（图7a）或抑制（图7b）情况。在丰度最高的网络中，ERBB2是本研究中几个差异表达基因的共同上游调节因子（图7c）。我们的数据预测了通过ERBB2抑制了雄激素受体（AR），但表现出较低的置信区间，反过来，可以通过CDKN1A分别起到抑制TP53、ESR2以及活化RB1，E2F，ESR1和EP300的作用。在CRC患者组织中，FOXM1网络也被高度富集，这反过来又激活了ER K1/2和SKP2。
6 PBMCs与CRC患者肿瘤组织基因表达的共性与差异
为了整合本研究的结果，探究CRC患者的PBMCs和肿瘤组织的整体变化，研究者确定了常见的上下调节转录本（图8a），以及常见的上下调节上游效应网络（图8b）。有趣的是，在CRC患者组织和PBMCs中都有18个常见上调基因。图8c更详细地描述了这些转录本及其热图，这其中包括来自健康供体的PBMCs、CRC患者的PBMCs、正常组织和肿瘤组织的数据。在PBMCs及其对应的CEC患者肿瘤组织之间检测到36个常见的下调转录本（图8d）。在PBMC和TT中也常有几种上游效应物被激活（图8b），这其中包括FOXO1、BRD4 ERK1/2、JUN、NEDD9、STAT3、ERK、JNK、TGFB1等，而只有一种上游效应物被共同抑制（COL18A1）。这些在PBMCs和组织中差异表达的转录本可以为破译CRC的系统改变提供有价值的起点。
讨论
在本研究中，科研人员探究了从大肠癌患者分离的PBMCs的转录组，并与健康对照组进行了比较。通过比对发现，两组患者PBMC的基因表达存在显著差异。并突出了癌症患者PBMCs转录组的明显变化，这一结果的发现表明这种变化并不局限于肿瘤微环境，而是系统性地反映出来的。这与基于单细胞测序、人类转录组阵列（HTA）和全基因组测序等方法所得的结果相一致。
IPA下游效应分析显示，与细胞运动、免疫细胞浸润相关的功能类别丰富，而与细胞死亡相关的过程减少。机制网络分析显示与TNF、IL1A和CCL5信号相关的多个网络被激活。有趣的是，包括IL-8和CXCL3在内的几种趋化因子，可以促进趋化、迁移和血管生成，同样IL-10和CXCL2（负责免疫调节和炎症），在大肠癌队列中显著上调。其他包括CCL3和CCL7的细胞因子的上调，表明巨噬细胞功能和白细胞募集水平更高。目前已有的研究发现，在培养的LoVo结肠癌细胞中，CXCL2和CXCL3表达的上调促进了肿瘤干细胞样特性和肿瘤的发生。这些趋化因子与IL8、IL10一起，在肿瘤的炎性微环境中发挥作用，甚至可以在癌前息肉中检测到，这一结果与本研究发现的相一致。
本研究表明，与正常对照组相比，结直肠癌患者的几个TLR表达下调。作为免疫细胞反应的组成部分，一旦异物或病原体相关分子模式（PAMPs）避开了皮肤或肠道等物理屏障，TLRs就提供了第一个识别点。TLRs的Toll/IL-1受体（TIR）结构域与髓系分化初级反应蛋白88（MyD88）相关，在大多数TLR中发现，包括我们的CRC队列中下调的TLR，负责下游信号转导，从而产生获得性免疫反应。TLR7在本研究中同样下调，其配体被认为是一种潜在的免疫治疗试剂。Loxoribine，一种TLR7配体，被证明在体内抑制结肠癌和肺癌异种移植瘤的生长。目前已有研究发现并提出了一种通过Loxoribine激活TLR7逆转Treg介导的抑制，促进CD4+ T细胞增殖和活化的机制。这与本研究显示的大肠癌患者TRL7下调的研究结果是互补的。由于受影响的PBMC中TLR7的表达较少，这就耗尽了TRL7拮抗剂介导的Treg抑制的机会，从而有助于肿瘤的发生发展。
为了进一步发现与结直肠癌相关的潜在基因特征，对来自同一队列的肿瘤组织及其邻近的正常组织进行了全转录组RNA-seq分析。基于基因的表达差异，研究者通过网络代谢分析确定了一些激活和抑制的上游调控因子。最显著激活的是ERBB2、RABL6、FOXM1和MITF。ERBB2（人类表皮生长因子受体2（HER2））的过度表达，主要与大约15-30%的乳腺癌（HER2阳性）有关。HER2在胃癌和卵巢癌中也表现出相似的现象。在一项针对大肠癌患者临床试验中，那些HER2过表达的患者在治疗后的短期存活率无明显进展。此外有研究表明，HER2可能使野生型RAS和BRAF患者对西妥昔单抗治疗产生耐药性。
受抑制程度最高的上游调节因子是TP53。TP53（或p53）是一种肿瘤抑制因子，已被广泛研究与癌症易感性有关。事实上，由于基因组的不稳定，p53基因缺陷的小鼠会在6个月内发展为自发性肿瘤。大多数已知的p53突变位于DNA结合区，具有显性的负性作用模式，在某些情况下已知会产生耐药性。在本研究的CRC队列中，差异表达的转录本显示p53作为一个共同的上游调节因子的功能受到抑制，从而促进了癌症的进展。基于对来自同一患者的循环免疫细胞和组织进行RNA-seq，使本研究能够在两种组织类型之间的差异表达转录本中寻找共性。有趣的是，大量的转录本被发现是共同的。这种重叠意味着可以在个人的基础上破译特定肿瘤微环境的特征，允许个性化的医疗护理。在CRC组织及其各自的PBMCs之间发现了18种常见的上调转录本。其中，AREG与各种类型的癌症和炎症有关。原位癌基因c-MET、VEGFA、CXCL3和MMP9在CRC生物学和免疫功能中起着重要作用。此外，在CRC PBMCs和它们各自的肿瘤组织之间发现了36种常见的向下调节转录本。这些表达的减少可能影响抗原的识别，导致与癌症进展相关的免疫细胞功能缺乏。这些基因中的许多似乎与癌症的发病和进展有关，同时在其他机体异常中起着作用。在下一步研究中，需要进一步了解这些在癌症中的确切作用，以及它们在CRC患者中的差异表达的影响。
总结
在本研究中，利用转录组分析，科研人员鉴定了一些差异表达的转录本，它们反映了肿瘤发生免疫细胞的系统效应，具有潜在的作为疾病生物标记物的用途。有趣的是，来自大肠癌患者的PBMC表现出诱导炎症免疫反应。循环免疫细胞变化作为大肠癌发生和监测疾病进展和治疗反应的潜在用途值得进一步研究。
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