科研 | IJMS：针对无花果皮中花青素生物合成关键基因的转录组研究（国人佳作）
编译：云佩b，编辑：十九、江舜尧。
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无花果为桑科落叶果树，富含花青素等有益于人体的成分。但关于花青素的分子结构信息较少。本研究采用了黄色阶段与红色阶段的无花果皮作为转录组研究材料。通过比较转录组研究，研究得到了6224个差异表达基因，而与花青素合成相关的有：5个CHS基因、3个CHI基因、3个DFR基因、3个ANS基因、2个UFGT基因、7个R2R3-MYB基因。然后克隆了3个花青素生物合成基因（FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1）和2个R2R3-MYB基因（FcMYB21、FcMYB123）；序列分析及分子特征表明，上述基因对无花果花青素生物合成有关键作用。异源表达FcMYB21、FcMYB123，能显著增加苹果果实及愈伤组织中的花青素积累，进一步说明其在无花果颜色调节中的作用。本研究为无花果花青素生物合成、呈色的分子机制提供了新的见解，还能促进无花果高花青素含量品种的基因改良以及其他农艺性状的改良。
论文ID
原名：Transcriptomic Analysis of Ficus carica Peels with a Focus on the Key Genes for Anthocyanin Biosynthesis
译名：针对无花果皮中花青素生物合成关键基因的转录组研究
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.32
发表时间：2020.02
通讯作者：汪良驹&安玉艳
通讯作者单位：南京农业大学园艺学院
DOI号：10.3390/ijms21041245
实验设计
实验流程图
结果
1.无花果皮的花青素含量
无花果发育过程中会出现色素沉着（图1A）；此现象与果皮中含有丰富的花青素是一致的（图1B）。黄色果皮中花青素含量极低，而随后5天内，果皮的花青素含量上升迅速，达到了28倍之多（图1C）。根据无花果皮的颜色，研究者选择未着色（黄色，Y）和已着色（红，R）果实用于后续实验。
图1 黄、红阶段的无花果着色及花青素含量。（A）黄、红阶段的无花果。标尺=5mm。（B）从黄、红阶段无花果提取的花青素颜色。（C）黄、红阶段无花果的花青素含量。图（A-C）中，黄色阶段为变色的开始，红色阶段为刚好成熟。小写字母代表显著性差异（p<0.05）。
2.文库构建、从头组装及注释
为鉴定花青素相关基因，作者分别构建了Y、R的cDNA文库。两类样品的原始读段总数从48,269,776到55,542,173不等。过滤原始读段，得到纯净读段数量从4千535万到5千278万不等。Q20百分比大于97%，GC百分比约47%。上述结果表明，测序数据足以保证从头组装的准确度。组装得到269684个转录本，平均长度为1126bp，N50长度2014bp。从中得到了186048个unigene，平均长度为1126bp，N50长度为2172bp。这些序列长度从200bp到2000bp不等，分为4组。102861个unigene（55.29%）长度至少为1000bp。
在7个公共数据库中对所有unigene进行比对，154920个unigene在至少1个数据库中匹配到同源序列。其中，74.27%（138194）的序列可比对到NCBI非冗余蛋白序列（Nr）数据库中的已知蛋白，全数据库比对率为14.99%（27893个）。E值越小，代表与已知的植物序列越相似。可匹配到Nr数据库的基因中，有68.20%的E值小于10-45。42.70%与已知基因的相似度达到80-95%，42.90%与已知基因相似度达到60-80%。约有15.60%的unigene与梅的序列有最佳匹配，其次是12.50%与桃有最佳匹配。
3.差异表达基因分析
与Y的文库相比，R文库中鉴定出6224个差异表达基因（DEG），包括58.15%的上调表达基因和41.85%的下调表达基因（图2A）。对DEG进行GO、KEGG功能富集分析，GO注释中，4566个DEG分为3大类：生物过程、细胞组成、分子功能。然而，富集子分类的前30项不属于细胞组成。生物过程项下主要子分类为“代谢过程”（63.12%）和“单器官过程”（50.64%）。在分子功能项下，“催化活性”（2691,59.94%）和“离子结合”（1612,35.30%）的数量最多。
在KEGG通路分析中，次生代谢产物的生物合成占前15位（图2B），如“黄酮生物合成”（ko00941）、“黄酮和黄酮醇生物合成”（ko00944）、“苯丙素生物合成”（ko00940）。特别的是，“黄酮生物合成”占多数，包括了74个DEG。
为确认转录组数据的可靠性，研究者随机选取了12个与花青素相关的DEG进行定量实时PCR（qRT-PCR）。扩增结果总体上与RNA测序结果一致，说明RNA测序数据有效。
图2 DEG的数量及KEGG分类。（A）黄、红阶段之间的DEG。（B）KEGG通路富集的前15个通路。富集因子表示同一通路中，DEG占总基因的比例。
4.与花青素生物合成相关的DEG
共有152个与花青素相关的unigene。研究者鉴定了其中的73个。排除47个CHS短小碎片后，剩余26个DEG。所有这些DEG在R阶段中都有高表达（图3）。其中6个基因属于苯丙素通路（2个PAL、1个C4H、3个4CL）。除了1个4CL（Cluster-11055.11791）上调表达了5.16倍之外，其他5个基因在R阶段表达的上调倍数都在2.52-3.00之间。仅1个F3H和3个F3’H有显著上调，它们和苯丙素通路上的5个基因有着相同的表达趋势，除了一个F3’H（Cluster-11055.82169）与4CL（Cluster-11055.63898）趋势一致。R阶段的CHS（Cluster-11055.81810）和CHI（Cluster-11055. 79888）的FPKM值超过了1000；这两个基因在R阶段的表达量分别是是Y阶段的3.19倍、3.90倍以上。2个CHS基因（Cluster-11055.103287、Cluster-11055.148622）和1个CHI（Cluster-11055.10763）的表达量则分别上调了32倍和16倍。与其他2个DFR（Cluster-11055.59172、Cluster-11055. 146588）相比，DFR（Cluster-11055.59175）显示出最高的FPKM值，上调表达了3.12倍。3个ANS和2个UFRT在R阶段的表达量增加了约7倍。
图3 花青素相关的结构基因的表达模式。圆圈数量代表基因数量，圆圈颜色代表 log2的值（变化倍数）。PAL=苯丙氨酸解氨酶，Cluster-11055.80692、Cluster-11055.82174; CHS, 查耳酮合酶, Cluster-11055.103287、Cluster-11055.148622、Cluster-11055.62221、Cluster-11055.71506、Cluster-11055.81810; CHI=查尔酮异构酶, Cluster-11055.10763、Cluster-11055.145351、Cluster-11055.79888; F3H=黄酮3-羟化酶,Cluster-11055.81147; F3’H=黄酮3’-羟化酶, Cluster-11055.77085、Cluster-11055.79806、Cluster-11055.82169; DFR=二氢黄酮醇还原酶, Cluster-11055.59172、Cluster-11055.59175、 Cluster-11055.146588;
ANS=花青素合酶, Cluster-11055.79464、Cluster-11055.79498、Cluster-11055.79715; UFGT, UDP-glucose=黄酮3-O-葡萄糖基转移酶,Cluster-11055.59183、Cluster-11055.59184。
5. 花青素生物合成的候选MYB
在DEG中筛选出19个MYB家族成员（16个上调，3个下调）。SMART预测的保守模体显示，7个基因含有完整R2、R3模体。而且这7个基因在着色过程中的表达量下降。Cluster-11055.82418在Y阶段的表达无法被检出。Cluster-11055.69229在这7个基因中的FPKM值最高，上调了1.55倍。
以126个拟南芥的R2R3-MYB蛋白、7个无花果DEG中的MYB蛋白构建系统发育树（图4A），Cluster-11055.86015与AtMYB123紧密相关，TT2型基因参与了花青素和原花青素生物合成调节。Cluster-11055.86015含有一个完整开放阅读框（ORF），将其命名为FcMYB123。Cluster-11055.69229与AtMYB21、AtMYB21处于同一分枝，后两者调节雄性育性或黄酮生物合成。Cluster-11055.69229与A tMYB21、AtMYB21氨基酸相似度分别为59.05%、58.77%。将其命名为FcMYB21。其他5个MYB基因分属不同分支。
图4 无花果和拟南芥R2R3-MYB蛋白系统发育分析以及FcMYB21、FcMYB123的多序列比对。（A）无花果和拟南芥R2R3-MYB蛋白系统发育分析。（B）FcMYB21的多序列比对。（C）FcMYB123的多序列比对。相同的残基以黑色表示，保守残基用粉红色表示（≥75%），相似残基（≥50%）用蓝色表示（B、C）。红、蓝线分别代表R2、R3模体（B、C）。AtMYB21（拟南芥，AT3G27810.1）、AtMYB24 (拟南芥, AT5G40350.1), AmMYB305 (金鱼草, P81391.1)、AtMYB123 (拟南芥, AT5G35550.1), MdMYB9 (苹果, DQ267900); MdMYB11(苹果, DQ074463)。
6. FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1的分子特征和序列分析
根据对花青素生物合成的转录组序列分析，从无花果皮中克隆得到FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1。FcCHS1全长ORF编码389个氨基酸，多肽的计算分子量（Mw）为4266kDa，理论等电点（pI）为6.12。FcCHI1编码257个氨基酸，Mw=28.14kDa，pI=6.15。FcDFR编码363个氨基酸。三者均为亲水性蛋白。二级结构均包含α螺旋、无规卷曲、β折叠和延伸链。α螺旋均匀分布于每条序列之中，无规卷曲占二级结构的31.91%~38.24%。β折叠在4种结构中占比最低，在7.97%~9.34%之间。将这些序列与负责花青素生物合成的同源序列比较发现，它们均为酸性氨基酸和亲水性蛋白。它们的二级结构占比相近，变异幅度小于4%。
在FcCHS1中发现若干保守活性位点（Cys 163、His 303、Asn 336），在10个序列上方以红色*表示（图5A）。观察到2个与底物专一性相关的苯丙氨酸（F）残基。系统发育树分析结果表明，CHS基因聚为3枝，FcCHS1与MnCHS1、MnCHS2（川桑）在同一枝。FcCHS1也与蔷薇科植物的CHS基因有紧密关联（图5D）。苔藓、蕨类的CHS蛋白作为外类群。经确认的FcCHS1与已知CHS蛋白同源。FcCHS1与MnCHS1、MnCHS2相似度达到94.86%。
图5 （A）FcCHS1的多序列比对。（B）FcDFR1的多序列比对。红、蓝线分别代表NADP结合区域和底物结合区域。红色星号代表FcDFR1识别底物专一性的关键残基。（C）FcCHI1的多序列比对。（D）CHI1的系统发育学分析。红色星号代表保守活性位点，红色点代表图（A、C）的催化性残基。图（A-C）的相同残基以黑色表示，保守残基用粉红色表示（≥75%），相似残基（≥50%）用蓝色表示。图（D-F）的无花果的FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1蛋白分别以红色三角表示。图（D-F）中，苔藓类CHS、BEN1蛋白和藓类CHI分别用作FcCHS1、FcDFR1、 FcCHS1系统发育分析的外类群。CHS, 查耳酮合酶; CHI, 查尔酮异构酶; DFR, 二氢黄酮醇还原酶, BEN1, BRI1-5 ENHANCED 1. MnCHS1(川桑, AHY35308.1)、 MnCHS2 (川桑, AHY35309.1)、 MdCHS (苹果, BAB92996.1)、 MtCHS (变叶海棠，DV29810.1)、 FaCHS (草莓，BAE17124.1)、 PaCHS (欧洲甜樱桃, AJO67963.1)、 PcCHS (西洋梨, AAX16494.1)、DzCHS1 (榴莲, XP_022721946.1)、 TcCHS1 (可可, XP_007034442.1);MnDFR (川桑, AHY35315.1)、 DzDFR (榴莲, XP_022769017.1)、PpDFR (桃, AJA79073.1)、 MdDFR (苹果, AAO39816.1)、 CsDFR(柑橘, NP_001275860.1)、 EgDFR (大桉, XP_010060970.1)、 JcDFR (麻风树, XP_012071899.1)、 FaDFR (草莓, AHL46451.1)、 QsDFR(西班牙栓皮栎, XP_023872028.1); MnCHI (川桑, AHY35310.1)、 JrCHI (胡桃, XP_018828033.1)、 QsCHI (西班牙栓皮栎, XP_023904011.1)、 DlCHI (龙眼, AEO36980.1)、 MdCHI (苹果, XP_008386466.1)、 PpCHI (桃, XP_007218371.1)、 CsCHI (柑橘, NP_001275866.1)、 ZjCHI (大枣, XP_015877049.1)、 PmCHI (梅, XP_008233532.1)。基因ID和物种名称见系统发育分析的括号中。
作者提出的FcCHI1的氨基酸序列与其他植物的CHI序列一样，在Thr49、Tyr107、Asn114、Ser191位点上存在保守残基（图5C），这些残基是产生CHI活性的必要条件。根据2个催化残基（红点，图5C）FcCHI1可能属于I型。邻接法构建系统发育树，分析结果显示，FcCHI1蛋白非常接近川桑的MnCHI（图5F）。系统进化树中，FcCHI1与其他CHI基因同源。推导的FcCHI1与PaCHI (欧洲甜樱桃)、MdCHI (Malus domestica)、PmCHI (梅)的相似度分别是60.85%、58.91%、57.36%。
FcDFR1与其他植物的DFR基因有着高度相似性，如川桑（76.76%）、榴莲（75.57%）、桃（75.14%）。FcDFR1序列在N端有一个包含21个残基的NADP结合区间。在129-156的TVNVEPQTKFFYDESCWSDIQFCRTV氨基酸序列是底物结合区域。天冬酰胺（N132）是FcDFR1底物专一性识别的关键残基（图5B）。系统进化树中，以BEN1蛋白（BRI1-5 ENHANCED 1, DFR样蛋白）作为外类群建树，证实了FcDFR1是典型的DFR基因。FcDFR1与MnDFR处于同一进化枝中（图5E）。
7. FcMYB21和FcMYB123的序列特征
根据无花果的RNA测序结果，从中分离出2个编码R2R3 MYB的全长基因。FcMYB21和 FcMYB123均含有R2、R3重复域。每个R重复片段由51-52个保守氨基酸残基组成（图4B、C）。FcMYB21、FcMYB123的全长ORF分别是684bp、1008bp，分子量分别是26.14kDa、37.37kDa，预测等电点分别是7.92、5.40。无规卷曲组分别成了FcMYB21、FcMYB123推测二级结构的49.78%、60.90%。FcMYB21、FcMYB123分别与AmMYB305、MdMYB9有着相似的二级结构。后两者被证明可以调节花青素累积。
8. FcMYB21和FcMYB123在苹果皮及愈伤组织中的作用
以苹果皮和愈伤组织材料进行为瞬时转染实验，观察FcMYB21和 FcMYB123的作用。把转入了FcMYB21或FcMYB123的农杆菌注射到苹果皮中，空质粒农杆菌为对照组。35::FcMYB21和35::FcMYB12显著提高了花青素在苹果皮中的积累，上调了包括MdCHS,、MdCHI,、MdDFR、 MdANS、MdUFGT在内的苹果花青素生物合成基因表达水平（图6A-C、F、G）。
图6 在富士苹果皮及愈伤组织中过表达FcMYB21、FcMYB123。（A）苹果皮中过表达的FcMYB21、FcMYB123。（B）野生型、转基因型苹果皮的花青素含量。（C）野生型、转基因型苹果皮的花青素提取物颜色。（D）野生型、转基因型苹果愈伤组织的花青素含量。（E）野生型、转基因型苹果愈伤组织的花青素提取物颜色。（F）FcMYB21瞬时过表达的苹果皮中各基因表达情况。（G）FcMYB123瞬时过表达的苹果皮中各基因表达情况。（H）FcMYB21瞬时过表达的苹果愈伤组织中各基因表达情况。（I）FcMYB123瞬时过表达的苹果愈伤组织中各基因表达情况。图（A-F）中，FcMYB21（OE）、FcMYB123（OE）分别代表携带了目标基因FcMYB21、FcMYB123的质粒。空载体pBI121用作对照组。同一基因上方不同字母代表显著性差异(p < 0.05)。
为验证注射实验，作者使用苹果愈伤组织验证FcMYB21和FcMYB123功能。与对照组相比，FcMYB21和FcMYB123过表达的愈伤组织外观更红，花青素累积水平显著更高（图6D、E）。异源表达FcMYB21和FcMYB123，可上调愈伤组织中花青素相关基因的表达水平（图6H、I）。上述结果表明，FcMYB21和FcMYB123在花青素生物合成调控方面可能有重要作用。
在FcMYB21和FcMYB123过表达的苹果皮和苹果愈伤组织中，MdMYB9和 MdMYB11表达水平下降或无显著变化。相反地，在FcMYB21和FcMYB123过表达的苹果皮和苹果愈伤组织中，MdMYC2和MdbHLH3表达水平大幅度提高。上述结果提示，FcMYB21和FcMYB123的作用可能与内源性的MdMYB9和MdMYB11无关，而与bHLH有关。
讨论
1. 无花果皮着色过程的转录组从头组装
基因序列信息的缺乏制约了人们对无花果着色的分子水平研究。第二代测序技术是一种有效、常用的获取大量序列的方法，特别是对于无参考基因组的植物。据研究者所知，在无花果的花青素生物合成通路上，前人仅克隆了FcANS1并给出序列信息。为将DEG数量最大化，作者选择了着色差异巨大的两个阶段的无花果进行测序。凭借颜色就能很容易识别无花果的变色阶段，因为这个阶段里面的无花果是黄色，而非深绿色。根据前人报道，黄、红两阶段之间花青素生物合成通路上的DEG与红、绿阶段之间的DEG几乎相同，因为这些基因在黄、绿阶段没有显著的表达量差异。因此，选择了黄、红阶段的无花果进行转录组分析。从两个文库中得到了186048个unigene，平均长度1498bp。之前对无花果的研究中，unigene的平均长度分别为683bp、302bp。本研究中的1498bp也比荔枝的737bp增加了一倍的长度。2017年曾针对无花果品种Horaishi使用Illumina平台结合鸟枪法进行全基因组测序，但其数据未发表。
以基因表达量变化倍数阈值>2且错误发现率<0.05为标准，分离到6224个基因。正如所料，RNA测序得到的DEG数量接近抑制性消减杂交法的60倍。使用抑制性消减杂交，仅从富士苹果皮和荔枝花芽中分别得到104、93个DEG。转录组质量满足后续分析需求。
2.无花果皮中结构基因的候选与克隆
无花果富含花青素。本研究是为了分析无花果皮中参与了花青素积累的关键酶和调节因子。在DEG中，鉴定了花青素生物合成各个步骤中的基因。PAL、4CL、C4H都是常见的多基因家族，被认为是限速酶。拟南芥有4个PAL，Populus trichocarpa有5个PAL、中粒咖啡有3个PAL。从拟南芥、大豆、水稻中发现的4CL成员数量分别是4、4、5。本研究中我们发现，2个PAL、3个4CL出现了上调表达， 说明无花果的PAL和4CL家族中的基因数量均在一个以上。与野生型拟南芥相比，At4CL3删失变异株中黄酮醇苷含量下降了约80%。人们曾预测Mn4CL3与黄酮生物合成相关。本研究中，Cluster-11055.81897（4CL）的氨基酸序列表明其余Mn4CL3有密切关系，因此作者认为Cluster-11055.81897是与着色相关的候选基因之一。据报道，拟南芥、欧芹只有一个C4H基因，这个基因会影响花青素和木质素的生物合成。与之相似，本研究中，上调表达基因池里面也只发现了一个C4H基因。它可能与无花果皮花青素积累有关。本研究获取了5个CHS、3个CHI、1个F3H、3个F3’H，它们都参与了二氢黄酮醇的合成，而且在红色果皮阶段的表达水平较高。CHS被认为是催化香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A形成2’,4’,6’,4-4羟基-查尔酮（柚皮苷查尔酮）的限速酶，也属于多基因家族。作者找到了5个长度长度超过700bp的CHS，另有47个长度为300bp左右的CHS。大量的短序列可能是同一基因的碎片。SMART数据进一步提示，CHS的unigene短片段未包含完整的保守区间。因此，这些短序列不能视作可用基因。CHI在CHS后面催化第二个反应。植物体内存在2种CHI。I型CHI普遍存在，II型主要存在于豆科之中。我们DEG中的3个CHI（Cluster-11055.10763、Cluster-11055.145351、Cluster-11055.79888）都是I型，可通过形成C15黄酮骨架将6’-羟基查尔酮异构化为5-羟基黄烷酮。F3H和F3’H也受到了人们关注。拟南芥F3H突变株（tt6）的种皮、叶片、茎中花青素含量均低于野生型。tt7突变株（AtF3’H）的种皮颜色从褐色变为象牙色。而与拟南芥的AtTT7、AtTT7基因比对匹配度最高的分别是F3H (Cluster-11055.81147)、F3’H (Cluster-11055.79806)，这表明它们可能在花青素生物合成中也有着类似的作用。
多种植物果实中DFR、ANS、UFGT的转录水平与花青素含量有着密切联系，如苹果、梨、草莓等。本文的类似结果见图3,DEG中的3个DFR、3个ANS、2个UFGT均上调表达。一个ANS (Cluster-11055.79498)的ORF与“Brown Turkey”品种中克隆得到的FcANS1（未上传至NCBI）完全一致，该基因参与了花青素生物合成。UFGT基因被认为是花青素生物合成的关键。前期报道显示，其转录水平和持续表达时间会影响花青素含量。本研究中，果实着色期间，Cluster-11055.59183、Cluster-11055.59184的表达水平与花青素含量一样急剧上升。尽管这两个基因都与桑的一个调节花青素生物合成的假定基因MaUFGT2有密切联系，Cluster-11055.59183的预测多肽序列与MaUFGT2的匹配相似度更高，提示它可能在无花果中起着相似的作用。
Wang等人声称克隆了6个无花果花青素生物合成的结构基因，FcCHS、FcCHI、FcF3H、FcF3’H、FcDFR和FcUFGT，并且这些基因可被光诱导表达，说明其在花青素积累方面的作用。然而， NCBI上并无相关基因序列信息，且该研究中未曾进行生物信息学分析。本研究重点放在发育过程，而非光照反应。我们克隆了FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1这些会随着无花果皮从黄变红而变化的基因。为查明它们在无花果花青素生物合成中的作用，我们进行了详细的序列分析和分子特征分析。与FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1同源，且被验证了在花青素生物合成过程中有作用的蛋白，在分子特征、二级结构占比方面均与FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1等相似，这提示了FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1在无花果着色过程中的作用。在基因过表达、删失的植株中，通过表型、代谢方法，在不同植物中均已证明了CHS、CHI的重要作用。抑制大丽花、龙蛋的CHS基因表达，会引起花白化。CHI编码区移码会产生金色洋葱。
DFR也是花青素生物合成的关节环节。拥有反义DFR基因的蓝猪耳能积累更多黄酮，其花色也比野生型的更蓝。根据134位的氨基酸残基，可将DFR分为3类：Asn型（天冬酰胺，N）、Asp型（天冬氨酸，D）、其他型。Asn型最常见，其他型只存在于少数物种中。但决定性氨基酸的位置会随着底物结合区域改变而不同。如GbDFR3的Asn在124位，而在MnDFR（Asp）和GbDFR1（赖氨酸，K）中分别处于132、154位。DFR利用二氢山奈酚、二氢杨梅素或二氢槲皮素作为底物，合成不稳定的无色花葵素、无色矢车菊素、无色飞燕草素。矮牵牛或蕙兰的杂交种的DFR属于Asp型，因此不能催化二氢山奈酚，导致花瓣中无法积累呈色的花葵素。FcDFR1为Asn型，所以底物的变化会引起无花果皮花青素种类和颜色的改变。经过多重比对，FcDFR1的编码区与其他植物的DFR有着高度相似性。FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1与其他维管植物中的相应基因一样，有相同的保守氨基酸残基。系统发育分析也支持它们分别与其他物种的CHS、CHI、DFR有紧密关系。上述结果表明，这几个基因确实是各自基因家族中其他已知蛋白的同源基因。而且FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1与川桑中相应的基因也有高度相似性和关联性。MnCHS1、MnCHS2、MnCHI、MnDFR1在烟草过表达植株中参与了花青素积累。无花果的这3个基因可能在果实着色方面的也有类似功能。FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1这3个蛋白均与来自蔷薇科的蛋白聚为一枝。这一信息也有助于预测基因功能和追踪进化过程。
3.无花果皮中MYB的候选和功能验证
MYB转录因子是植物中最大的基因家族之一，在植物生长、发育、胁迫应答方面都充当中央调控者的角色。AtMYB14在拟南芥的霜冻抗性方面有重要作用。AtMYB108和AtMYB24是控制花药发育的的冗余基因。AtMYB44是参与了脱落酸介导的胁迫应答过程的候选基因之一。鉴定了7个R2R3-MYB基因。其中，Cluster-11055.106720和Cluster-11055.107006与AtMYB14相似。Cluster-11055.106720 与AtMYB108聚为一枝，Cluster-11055.107006与AtMYB44聚为一枝。结果表明，它们可能是无花果发育和胁迫响应的潜在调控因子。
MYB转录因子另一个作用是调控果实、花朵的颜色形成。R2R3-MYB在拟南芥身上已得到了深入的研究，尤其是在第6亚组中的AtPAP1和AtPAP2。Wang等人对无花果皮进行的转录组研究表明，c43569_g1蛋白序列与调控苹果红肉表型的关键PAP1型蛋白MdMYB110a有高度相似性（72%）。然而，本研究中作者未发现与AtPAP1同源的MYB基因。而且，基因组范围内对桑葚MYB转录因子的分析显示，没有MYB能够归到第6亚组。因此，PAP1型基因是否存在于无花果的问题仍有待进一步研究。另一个R2R3-MYb转录因子AtTT2能增加拟南芥种皮中原花青素而非花青素的积累。然而，把和AtTT2近缘的MdMYB9过表达，却显著提高了苹果愈伤组织中的花青素含量。FcMYB123与MdMYB9有着高度相似的二级结构，提示它们可能参与了无花果花青素生物合成的调控。
本研究鉴定了2个R2R3-MYB蛋白，根据它们与126个拟南芥R2R3-MYB基因的系统发育学分析结果，将其分别命名为FcMYB21和FcMYB123。推导的FcMYB21氨基酸序列显示出与AtMYB21的高度相似性，与MYB305有着密切亲缘关系。FcMYB21与AmMYB305有64.47%相似度，还拥有与AmMYB305相似的二级结构，这个二级结构可以促进拟南芥的黄酮生物合成。FcMYB21可能也在次生代谢中以相同方式发挥作用。FcMYB123实际上是一个TT2型的调控因子，尽管有报道指AtTT2调控的是原花青素生物合成。An等人最近发现，过表达MdMYB9或MdMYB11这两个AtTT2的同源基因，可以增加苹果愈伤组织中的花青素含量。桃中TT2样基因被证明在促进花青素积累方面有一样的作用。因此，FcMYB123可能也参与了花青素的积累。
在无花果的果实和愈伤组织中进行农杆菌介导的瞬时转染是难以检测的，因为无花果皮难以分离。同时，在无花果愈伤组织中进行基因瞬时转染也难以操作，因为愈伤组织在12小时内就会褐化。以苹果皮和愈伤组织为材料的转染系统快速兴起，它能够有效地研究基因过表达及沉默。本研究中，为验证FcMYB21和FcMYB123的功能，我们使用苹果皮及其愈伤组织进行瞬时表达实验。结果表明，过表达FcMYB21和FcMYB123能显著增加苹果皮和愈伤组织中花青素含量。在烟草中过表达LcMYB1，诱导了花青素在花中的积累，并抑制花中原有的与花青素合成相关的MYB基因NtAn2的表达。在苹果皮和愈伤组织中下调MdMYB9和MdMYB11的结果与之相似。这些结果表明，MdMYB21和MdMYB123在花青素生物合成方面的作用可能与内源性的MdMYB9和MdMYB11无关。bHLH的MdMYC2和MdbHLH3伙伴基因在FcMYB21和FcMYB123过表达材料中分别都有显著的表达上调。这与MrMYB1的结果相似。在拟南芥中过表达MrMYB1，会引起叶片中花青素累积，而AtTT8表达量也会上调。多项研究表明，bHLH转录因子AtMYC2与AtMYB21相互作用，并进一步增强AtMYB21在可育性方面的作用。相似地，在苹果皮和愈伤组织中，过表达的FcMYB21增强了MdMYC2的表达水平。作者怀疑，FcMYB21促进无花果花青素积累，而且它的作用可能与FcMYC密切相关。另外，MdANS1和MdbHLH3的表达量在苹果皮和愈伤组织中均有增加。FcMYB123会与bHLH转录因子互相作用，可能主要募集在FcANS1的增强区。FcMYB21和FcMYB123影响无花果着色的相关问题需要进一步研究。
基于RNA测序，本研究克隆了3个参与花青素生物合成的候选结构基因FcCHS1、FcCHI1、FcDFR1。在苹果中瞬时表达两个R2R3-MYB基因，揭示了它们对花青素积累的调控机制。尽管它们在无花果中的功能有待进一步研究，但本研究还是为无花果花青素生物合成研究提供了一些分子层面的基础。
评论
无花果是重要的果树作物，其中所含有的花青素对人体具有多种好处。提高作物的花青素含量具有重要意义。本研究选取黄、红两阶段的无花果作为转录组研究材料，联合花青素含量的测定，得到了与花青素生物合成紧密相关的若干结构基因和转录因子。通过生物信息学分析和系统发育分析，初步确定了这些蛋白的功能位点、分类地位及其功能。将可能调控花青素生物合成的两个转录因子转入农杆菌，使用苹果皮和愈伤组织作为瞬时转染材料，qRT-PCR和花青素含量测定均证明了两个候选因子的过表达对花青素结构基因具有增强表达作用。本研究为无花果的品种改良提供了分子层面的依据。
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