编译：景行，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
多动腿综合征（RLS）是一种常见的与睡眠相关的感觉运动障碍，其特征是在晚上或夜里腿部感觉不舒服。运动可以部分缓解此病状，受影响的个体通常需要在休息时间行走，这会干扰睡眠。GWAS已经鉴定了19个与RLS相关的基因座（例：SKOR1非编码区的变异）。在小鼠中，Skor1作为Lbx1转录因子的核心抑制因子，这两个基因共同作用，调节脊髓背角中间神经元的细胞命运。基于这些数据，研究者使用全RNA-seq测序方法研究了SKOR1在人类细胞系中的调节作用(SKOR1或过表达，或沉默)。对于这项工作，研究者生成并验证了一个新的多克隆抗体(SKOR1)。差异表达基因的通路和基因集富集分析显示，富集的基因通路中与RLS相关的途径有神经发育和铁代谢。研究者对不同数据集的分析进一步支持并强调了SKOR1的调节作用，当调节失调时，它可能代表了RLS的一个关键致病因素。更好地理解SKOR1及其活性可以为开发一种急需的疗法开辟新的研究途径。
原名：SKOR1 has a transcriptional regulatory role on genes involved in pathways related to restless legs syndrome
译名：SKOR1对参与多动腿综合征相关途径的基因具有转录调节作用
期刊：European Journal of Human Genetics
IF：3.657（2019）
发表时间：2020.6.22
通讯作者：Guy A. Rouleau
通讯作者单位：加拿大麦吉尔大学人类遗传学系
DOI号：10.1038/s41431-020-0670-4
多动腿综合征(RLS)在遗传学方面取得重要成果，然而潜在的生物学方面的机制研究远不够深入。RLS的遗传力估计在60%左右。迄今为止，连锁和全基因组关联研究(GWAS)分别报告了8个和19个RLS基因座。与这些遗传发现相关的致病缺陷的后续研究也正在进行中，这些研究针对的只是其中一些遗传风险因素。研究发现位于MAP2K5/SKOR1之间的基因间区域的变异体与RLS相关，并且这种关联在不同人群中重复出现。虽然关联信号是基因间的，但研究者以前报道过此类变异似乎涉及SKOR1而不是MAP2K5。基因型-组织表达(GTEx)数据库显示，SKOR1表达在小脑和小脑半球最高。在小鼠胚胎中枢神经系统(CNS)中，Skor1在中脑-后脑边界后的有丝分裂后神经元的某个亚组中表达。在发育中的小鼠脊髓中，Skor1在背角中间神经元中选择性表达，同源域转录因子Lbx1也在此处表达，这两种蛋白质共同调节该区域中间神经元的细胞命运。Skor1与Lbx1相互作用，并协同抑制转录。SKOR1作为一种与RLS相关的遗传风险因子具有重要意义，但其对与RLS致病性相关的途径的调控机制却知之甚少。本研究使用RNA-seq测序方法研究SKOR1在人类细胞系中的调节作用(SKOR1或过表达，或沉默)，产生了识别人SKOR1的兔多克隆抗体，用于鉴定这些细胞中的SKOR1。对不同的RNA-Seq数据集的分析表明，SKOR1作为与神经发育相关的基因的转录抑制因子，与之前报道的小鼠背根中的转录抑制功能一致。研究数据还显示SKOR1对铁死亡相关基因有积极的调节作用。（Ferroptosis，是近年来发现的一种由铁依赖的氧化损伤引起的细胞死亡模式，与凋亡、坏死、自噬不同）。过去的RLS文献支持SKOR1和MEIS1之间的联系，MEIS1是GWAS发现的另一个与铁代谢有关的基因，这两个RLS相关基因在铁代谢、RLS以及它们的其他可能的相互作用因子(这两个转录因子的调控网络中是共同的)中的作用有待进一步研究。
SKOR1过表达或敲除的人细胞系
克隆基于GTEx在脑-小脑和脑-小脑半球高表达的SKOR1基因的ORF（PC DNA3.1质粒，CMV启动子）。使用Sanger测序验证了质粒的cDNA序列。用载体转染人HAP1细胞和HEK293细胞，用G418抗生素选择稳定的高表达SKOR1的细胞系；转染48小时后，将细胞转移到含有500ug/ml G418的培养基中，每隔一天更换培养基持续4周，以获得过表达SKOR1的稳定细胞系。该病例和对照条件至少分三次完成。SKOR1-KO HAP1细胞与SKOR1-OE细胞用于RNA-Seq。
抗SKOR1多克隆抗体的产生和鉴定
两种不同的肽序列用于制备SKOR1多克隆抗体(肽1:MERKLEREFQSLKDN和肽2: SNRFPDDEDAQEETE，图1a)。肽1是研究者小组设计的。图1a中所示的SKOR1_HUMAN蛋白序列(UniProt标识符P84550-1)被用作表位分析的参考序列。通过Protean软件识别SKOR1蛋白的免疫反应区。用每一个肽序列对两只新西兰白兔在进行免疫实验。在73天后，用过表达SKOR1ORF的HEK293细胞进行westernblot分析，对最终出血进行抗体鉴定。
从人类细胞系中提取RNA
从人类细胞系中提取的总RNA（RNeasy® mini kit）。使用2100 Bioanalyzer instrument以及2100 Expert Software和Bioanalyzer assays(所有RNA样品的RIN > 9)对RNA完整性数(RIN)进行评估。
高通量转录组测序和生物信息学分析
IlluminaHiseq4000平台，每个样本(在Macrogen公司)总共有1亿次读取，用于RNA测序。
抗SKOR1多克隆抗体的制备及鉴定
使用2种不同的人SKOR1特异性肽序列制备抗SKOR1多克隆抗体。肽1：MELRKKLEREFQSLKDN（兔子#6033和#6034）在人/鼠/鼠中具有100%的同一性，而肽2：SNRPDDED AQEETE（兔子#6035和#6036）是人类特有的。SKOR1蛋白中两个肽的位置和SKOR1的完整肽序列如图1a所示。免疫13周后的兔子的出血用于蛋白质印迹分析，以测试不同抗血清中抗体的亲和力和特异性。这一过程是在过表达SKOR1开放阅读框(ORF)的HEK293细胞进行的（该开放阅读框在CMV启动子下被亚克隆到多克隆抗体3.1+载体中）。测试从肽序列的两个重复获得的最终出血，蛋白质印迹结果显示在图1b，c中。来源于肽1(兔#6034)的抗血清显示SKOR1的强过表达，由非特异性结合产生的背景噪音低，并被选择用于后续实验(SKOR1分子量为约100 kDa)。由于HEK293细胞表达的蛋白水平较低，因此无法在蛋白质印迹法上检测到内源性SKOR1蛋白水平。
图1. a.SKOR1蛋白中肽1和2的位置示意图和SKOR1的完整肽序列用作表位分析的参考。b.新西兰兔产生的多克隆抗体的蛋白质印迹分析。用肽1免疫兔子#6033和#6034。c.在新西兰兔体内产生的多克隆抗SKOR1的蛋白质印迹分析。用肽2免疫#6035和#6036兔。d.使用#6034抗体对过表达SKOR1的HAP1细胞进行蛋白质印迹分析。黑色箭头表示转染细胞与其亲代野生型细胞相比SKOR1过表达带(SKOR1表观分子量约为100 kDa)。
SKOR1失调的人类细胞系的产生
为了鉴定受SKOR1调控的基因，研究采用两种不同的人类细胞系:HAP1和HEK293，其中HEK293细胞(由anti-SKOR1 #6034测试)用于以稳定的方式产生过表达SKOR1的细胞系。此外，SKOR1的ORF也在HAP1细胞中使用相同的带有CMV启动子的pcDNA3.1+载体过表达，并且它们通过蛋白质印迹分析进行了鉴定(图1d)。HEK293和HAP1稳定细胞系均显示SKOR1过表达。HEK293来源细胞的SKOR1过表达更强，可能是因为这些细胞比HAP1细胞转染效率更高。使用两种不同的人类细胞系的是为了最大限度地减少识别特定于单一细胞类型的表达变化的可能性，因此，在两种细胞类型的数据集中观察到的变化更有可能与SKOR1调节功能有关。研究者认为在这些OE细胞中上调或下调的基因可能分别被SKOR1转录活性激活或抑制。除了来源于SKOR1-OE细胞的RNA序列数据集外，还产生了来源于SKOR1敲除(SKOR1-KO) HAP1细胞及其亲本野生型(WT)细胞(来自Horizon)的数据集。SKOR1对SKOR1-OE细胞中上调或下调基因的调控方向应该在SKOR1-KO中以相反的方向观察。
人SKOR1基因表达异常细胞系的差异表达分析
使用从SKOR1表达失调的人细胞系(OE和KO)中提取的总RNA样品进行RNA-seq分析。使用edgeR算法进行差异基因表达分析，对比设计如下：
HAP1-OE vs. HAP1-WT; HAP1-KO vs. HAP1-WT; and HEK293-OE vs. HEK293-WT。两个细胞系中的RNA序列分析的多维标度图分别显示了每种条件下的重复簇(图2a，b)。MD(平均差异)图也显示差异表达基因(DEGs)的分布，并且HAP1细胞和高表达SKOR1的HEK293细胞都显示了对应于SKOR1的数据点作为最差异表达的基因(图2c-e)。在OE细胞中上调而在KO细胞中下调的DEGs被认为可能由SKOR1(19个基因)激活。相反，在OE细胞中下调而在KO细胞中上调的DEGs被认为可能被SKOR1抑制(44个基因，图3)。每个细胞系中的DEGs、它们相应的P值和错误发现率(FDR)可以在补充表中找到。
图2. SKOR1基因过表达或沉默的人细胞系的RNA-Seq数据分析。a.在HAP1中分析的RNA-Seq数据的MDS图，包含HAP1 SKOR1-KO（红色），HAP1 SKOR1-OE（绿色）和HAP1亲代WT细胞（蓝色）簇。b.在HEK293细胞中分析的RNA-Seq数据的MDS图，包含HEK293 SKOR1-OE（红色）和HEK293 WT细胞（蓝色）簇。c.DEGs的MD图，比较过表达SKOR1的HAP1细胞与亲代野生型细胞；LogFC高的单个数据点表示SKOR1。d.DEGs的MD图，比较过表达SKOR1的HEK293细胞和野生型细胞；LogFC高的单个数据点表示SKOR1。e.DEGs的MD图，比较HAP1 SKOR1-KO细胞与其亲代WT细胞(注：c、d和e中的蓝色数据点对应于FDR < 0.05的DEGs)。
图3 HAP1细胞和HEK293细胞间常见DEGs的韦恩图。左图显示的是HAP1 SKOR1-OE中上调的DEGs、HAP1 SKOR1-KO中下调的DEGs和HEK293 SKOR1-OE中上调的DEG之间的重叠；研究认为SKOR1可能调控所有三个数据集共有的19个DEGs。右图显示的是在HAP1 SKOR1-KO细胞中上调的DEGs、HAP1 SKOR1-OE和HEK293 SKOR1-OE细胞中下调的DEGs之间的重叠；研究认为SKOR1可能抑制所有三个数据集共有的44个DEGs。
通路和基因集富集分析显示与已知的RLS机制相关的途径
基因和基因组的GO注释和KEGG通路富集使用Enrichr为DEGs（差异表达基因）编辑信息，并通过Cytoscape可视化它们的相互作用(图4)。44个似乎被SKOR1抑制的DEGs显示与神经发育过程相关的通路显著富集(表1)，这些途径包括轴突导向、脊髓发育、神经胶质细胞发育和突触后组装，这一结果与Mizuhara等人先前的观察结果一致。他们描述了Skor1在小鼠中的表达，基于他们的工作，Skor1在调节脊髓背角细胞命运决定中充当Lbx1的转录辅抑制因子。除了神经发育途径之外，还发现其他途径，包括铁死亡途径，该途径在19种可能由SKOR1激活的基因中显著富集(表2)。铁死亡是一种与铁相关的非凋亡性程序性细胞死亡形式，其中活性氧的积累导致氧化应激和死亡，这个过程依赖细胞内的铁而不是其他金属。抑制铁死亡可以保护机体免于神经退行性疾病，并且它与包括帕金森氏病和阿尔茨海默氏病在内的多种神经性疾病有关。根据目前的文献，脑铁异常是RLS神经系统中最强有力的观察。此外，研究者还观察到HMOX1(血红素加氧酶1)存在于这种铁死亡途径中。HMOX1是一种血红素降解蛋白，除了产生一氧化碳和胆绿素外，还产生游离铁，这个基因被认为在大脑老化和神经退化中起作用。最近研究者小组还报道了HMOs1是MEIS1调节网络的一部分(MEIS1对HMOs1的表达有积极的调节作用)。除了铁死亡，还发现其他途径显著富集了由SKOR1激活的基因(表2)，这些途径大多涉及蛋白质翻译、离子运输、氨基酸等。目前关于RLS神经系统方面的知识不足以让研究者将这些途径与RLS神经系统联系起来。鉴于SKOR1功能的研究很少，其作用还有很多待了解，这些其他途径应该在未来的SKOR1研究中加以考虑。本文报道的新抗体将有助于进一步促进SKOR1在RLS相关方面的研究。
图4在可能被SKOR1抑制或激活的DEGs中显著富集的途径之间的相互作用。交互通过ClueGO和Cluepedia(Cytoscape软件插件)可视化。圆圈的大小对应于它们的p值。这些路径根据分组进行着色。
表1 被SKOR1抑制的DEGs中显著富集的途径。
表2 被SKOR1激活的脱辅基细胞中显著富集的途径
多动腿综合征是一种与睡眠相关的运动障碍，在西方国家的老年人群中普遍存在，但其发病和发展的潜在途径却没有明确的定义。RLS是一种复杂的疾病，遗传和环境条件(例如，脑铁失调、肾病和妊娠)都可能影响其发生发展。本研究旨在阐明SKOR1对RLS机制的贡献。先前有报道过SKOR1和MEIS1(另一种RLS相关基因)之间的联系，发现淋巴母细胞样细胞系RLS患者丘脑中MEIS1的表达减少与SKOR1表达减少有关。研究者基于SKOR1在神经系统中的转录活性，试图评估其在RLS转录组范围内的调节作用，为此，研究者控制SKOR1在HAP1和HEK293细胞中的表达，并使用RNA-seq方法研究了SKOR1的转录调节功能，将HEK293 SKOR1-OE的转录组与野生型HEK293细胞的转录组进行比较。对于部分单倍体的HAP1细胞(Horizon)，用CRISPR-Cas9灭活它们的单一等位基因SKOR1。将SKOR1-KO HAP1细胞以及SKOR1-OE HAP1细胞的转录组与其保留SKOR1表达等位基因的亲代野生型细胞进行比较。合理的假设是，HEK293和HAP1数据集之间共享的DEG是SKOR1的下游目标。使用两个不相关的人类细胞系是为了在解释DEGs时减少细胞特异性转录组的变化。SKOR1转录组数据的交叉验证分别鉴定了44个和19个被抑制或激活的基因。对这两个数据集进行功能注释，并基于它们与已知的RLS相关途径的联系对结果进行研究分析，在可能被SKOR1抑制的44个基因中，多数参与神经发育过程，如轴突导向、神经胶质细胞发育、脊髓发育和突触后组装。2017年研究者对GWAS淋巴瘤的荟萃分析包括15，126例病例和95，725例欧洲血统的对照，进行了类似的功能注释分析，也观察到神经发育基因的富集，这些基因也与轴突导向、突触形成和神经元规格有关。本研究细胞模型进行的富集分析与大规模荟萃分析进行的富集分析之间的相似性支持了SKOR1对导致RLS的致病事件有重要作用。此外，文献中有证据支持RLS神经系统包括神经发育障碍的某些方面。例如，Spieler 等人的一项研究表明，老鼠体内的相关风险因素会降低它们的增强子活性，这种减少发生在产生基底神经节的外侧/内侧神经节突起。RLS相关基因在神经发育中的富集，参与基底神经节发育和SKOR1调节基因在神经发育过程中的富集(在本工作中发现)都支持神经发育作为RLS研究的新焦点。本研究细胞模型中由SKOR1激活的19个基因进行的富集分析，发现铁死亡途径显著富集。铁死亡是一种与铁有关的细胞程序性死亡，它是由活性氧和氧化应激的积累引起的。已知RLS患者存在脑铁调节障碍，因此在SKOR1调节基因中鉴定这种铁相关途径是有意义的。由HMOX1(血红素加氧酶1)编码的蛋白质是铁死亡途径的一部分，它将血红素降解为胆绿素、一氧化碳和亚铁离子。有人提出HMOX1与大脑老化和神经退化有关，考虑到据报道该基因与西班牙队列中的RLS之间存在小的关联，这一观察可能与RLS有关。据报道，HMOX1也位于MEIS1转录因子的下游。值得注意的是，在研究者早期的出版物中，研究者也观察到了MEIS1对SKOR1的积极调节作用，这些结果表明存在一个涉及这三个基因的调控网络，研究者认为这个网络值得进一步研究。在这项研究中使用人类细胞系提供了一个标准的体外模型，用于研究RLS中调节失调的SKOR1的作用和意义。总的来说，研究者的观察支持SKOR1转录调控作用在RLS发病和进展中的作用，这一新发现为未来的调查研究开辟了新的视野。然而，体外研究有一些局限性。例如，专门在神经元细胞中表达的基因和途径可能在这项研究中被遗漏了。未来的后续研究可以利用神经细胞系，如干细胞，或实际的脑标本，这些样本对于验证本文的发现并将其与RLS联系起来也非常有用。体外和未来的体内研究将有助于研究人员更准确地了解RLS神经系统的病理生理学，并最终发展出更有效和持久的治疗方法。遗传和环境条件(例如，脑铁失调、肾病和妊娠)都可能调节RLS发病。本项研究基于SKOR1在神经系统中的共加压转录活性，使用RNA-seq方法研究了SKOR1的转录调节功能，发现SKOR1抑制的多个基因参与神经发育过程，如轴突导向、神经胶质细胞发育、脊髓发育和突触后组装，SKOR1激活的基因在铁死亡通路显著富集，而RLS患者存在脑铁调节障碍，因此在SKOR1调节基因中鉴定这种铁相关途径是有意义的。此外，HMOX1也位于MEIS1转录因子的下游，MEIS1对SKOR1的积极调节作用，表明存在一个涉及这三个基因的调控网络，这个网络值得进一步研究。总的来说，观察支持SKOR1转录调控作用在RLS发病和进展中的作用，这一新发现为未来的调查研究开辟了新的视野。
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