科研 | 美国麻省理工大学与哈佛大学博德研究所Anna Greka等：人肾类器官的单细胞普查显示可重复性，移植后脱靶细胞减少
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Single cell census of human kidney organoids shows reproducibility and diminished off-target cells after transplantation
译名：人肾类器官的单细胞普查显示可重复性，移植后脱靶细胞减少
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2019.11
通讯作者：Anna Greka
通讯作者单位：美国麻省理工大学与哈佛大学博德研究所
DOI号：10.1038/s41467-019-13382-0
实验设计
iPSC的培养及类器官的分化：两个商业品系ThF女性和Alstem的AS男性来自Thermo Fisher，两个人类健康供体来自N1女性和N2男性。所有iPSC使用mTeSR1培养基在T25中培养。肾脏类器官的分化分别使用ML和JB的实验方案。
单细胞测序：使用Accumax和27G syringe等分离单细胞。样品进行匀质，过滤，离心，制成细胞悬液。制备10X Chromium文库，使用Illumina HiSeq平台测序。
免疫荧光：类器官经过固定、脱水和OCT包埋后，进行冰冻切片。切片经过洗涤、封闭、一抗和二抗结合后，使用共聚焦显微镜进行成像。
动物实验：所有动物实验委托Biomere公司进行，所有操作都经过实验动物使用与管理委员会（IACUC）的允许。
生物信息学分析：测序数据经过质量过滤后，使用Cellranger toolkit（v2.1.1）软件比对到人类参考基因组上，使用R语言Seurat（v2.3）进行表达基因的分析。
结果
来自四种人iPSC品系45万个细胞的49个肾脏类器官的状态
为了在单细胞分辨率下比较类器官，研究者使用了两种方案对四种不同的人类iPSC品系以及每个品系多个分化的时间点制成单细胞悬液。基于液滴scRNA-seq对单细胞进行了测序（图1a）。使用ML的方案，从两个商业品系（Thermo Fisher的ThF女性和Alstem的AS男性）以及从两个人类健康供体（N1女性和N2男性）中分别获得了类器官。分别在iPSC的第0天（D0）、第7天（D7，将细胞铺板进行3D成形和肾发生之前）、第15天（D15，生长因子介导结束时）以及类器官成熟的第29天（D29）进行了单细胞分析。该实验的设计使研究者能够评估方案的可重复性、iPSC多能性以及后续分化中细胞系特异性差异带来的影响。接下来，在D29研究者使用JB的方案对ThF的iPSCs获得了肾脏类器官（图1a）。为了计算技术差异，还对来自三个不同的iPSC重复（D15、D29、所有品系）和一个额外的独立传代（D7、D15、D29的AS品系和D7的TF品系）的单细胞进行了测序。研究者成功地从所有四种iPSC品系的类器官中分离出382465个单细胞（图1b），并将它们与来自三个成年男性肿瘤肾切除术中未受影响的皮质和髓质肾部分的17759个细胞进行了比较（图1c）。使用无监督的聚类，随后对细胞类型的标记基因和细胞周期的标记基因进行注释，确定了类器官的细胞组成。
来自所有四种iPSC品系的D29类器官均包含发育中的肾单位细胞（图1c，d）：足细胞（NPHS2，podocin；NPHS1，nephrin；SYNPO，synaptopodin；WT1，Wilms Tumor 1）、近端肾小管（PT）细胞（LRP2，巨蛋白）、远端小管直部细胞（TAL；SLC12A1，Na-K-Cl共转运蛋白）和远端肾单位细胞（CDH1，E-钙黏着蛋白；AQP2，水通道蛋白2；GATA3）。使用tSNE可视化数据时，发现与成年肾脏中看到的离散细胞簇不同，类器官单细胞分布图保留了人肾单位的近端（足细胞）到远端的轴（图1c）。研究者对数据来源的标记基因进行了鉴定，包括近端肾小管细胞簇中的骨桥蛋白（SPP1）以及远端肾单位细胞簇中的WFDC2和MAL（图1d），这些结果与成人和胎儿肾脏scRNA-seq研究一致。在所有四种iPSC品系中，观察到APOE（一个与糖尿病性肾脏疾病相关的基因）从近端至远端肾小管梯度分布（图1d）。因此，D29类器官可重复地发育成足细胞、近端肾小管细胞以及与TAL和远端肾单位一致的细胞（但在成年肾脏中没有明确的远曲小管（DCT）或收集管（CD）节段）。
D29类器官还包含PAX2、LHX1和PAX8（特定细胞类型差异表达基因）特异表达的肾单位祖细胞（NPC）。大部分类器官单细胞（平均70％）是间充质细胞（图1c），分为富含祖细胞和分化细胞类型标记基因的八个亚型（间充质1-8）（图1c）。在D29类器官中发现了成年人肾脏中不存在的非肾脏脱靶细胞（图1c），包括黑色素瘤样细胞（PMEL）、SOX2+阳性神经元前体细胞、STMN2+神经元样细胞和MYOG+肌肉样细胞。研究者还观察到了非常少的内皮细胞（EC）（图1c）。
比较了D29人肾类器官（ThF品系）与人肾组织的细胞簇，特别是孕早期（8周）和孕中期（17周）的胎儿肾以及成年人肾的细胞簇（图1c）。使用基于分类的方法（随机森林算法），评估了类器官和人肾组织细胞簇之间的对应关系（图1e-g）。
总体而言，类器官细胞与孕早期和中期胎儿肾脏最相似，这与以前的研究基本一致（图1e，f）。通过算法所有肾单位细胞谱系都进行了准确分类（图1e–g）。与成年人类肾脏相比（图1c），所有类器官均含有人类肾单位的细胞，但远端肾小管细胞分化较差。相比之下，在成年人肾脏中，发现了明显的近端、Henle环（LoH）、DCT和CD亚细胞簇，包括主细胞（PC）和α-与β-闰细胞（IC），以及内皮和免疫细胞簇（图1c）。
有趣的是，肾脏类器官中的某些间充质细胞类型可预测胎儿和成年肾脏中的细胞类型，表明这些是靶向的间充质细胞。胎儿肾细胞类型（间质、内皮和成纤维细胞）在类器官中被分为间充质1、2和5细胞簇（图1e，f）。而成年人肾小球的系膜细胞、成纤维细胞和周细胞在类器官中被分为间充质1和5细胞簇（图1g）。类器官中的间充质细胞簇2富含MGP、GAS2、PRXX2和FOXP2的表达，这些是发育中的肾小球系膜细胞的已知标记基因。同样，类器官中的间充质细胞簇5富含胎儿基质基因SULTIE1、DKK1、NR2F1、ID3、ZEB2、COL6A3和DCN的表达。相反，未映射到人肾细胞类型的间充质细胞簇4富含与软骨形成相关的基因（ACAN、SOX9、MATN4、LECT1、EPYC、COL9A3和COL9A1）（图1e，f）。
为了直接将类器官与人肾细胞进行比较，研究者对成熟的类器官和人肾脏进行了配对联合聚类分析。确定了与随机森林（RF）算法预测的肾单位一致的肾细胞类型：足细胞、PT、TAL和远端肾单位。胎儿和类器官细胞的联合聚集表明，共有的增殖状态和肾单位祖细胞状态在成年人肾脏中不存在（与RF结果一致，图1e-g）。特别令人感兴趣的是，类器官GATA3+远端肾小管细胞与成年CD主细胞和孕中期远端肾小管细胞簇共同聚集，但不与孕早期远端肾小管细胞簇聚集。尽管以前已经报道过GATA3+细胞，但深入分析发现了CDH1+/GATA3+管状上皮类器官细胞簇，该细胞簇可能代表正在发育的CD主细胞结构，比孕早期肾脏更成熟。
图1 来自四种不同的人iPSC品系的成熟肾脏类器官包含主要的肾单位细胞类型。
在联合聚类分析中，间充质细胞类型包括类器官特异的间充质细胞类型（O-间充质-2，富含COL9基因的表达）、成年/胎儿特异细胞类型（周细胞、成纤维细胞和血管平滑肌细胞）和共享的类器官-胎儿间充质细胞。脱靶细胞类型仅在类器官中，除了在第8周胎儿数据中也发现了的STMN2+神经元细胞。类器官中不存在胎儿和成人特异的内皮细胞和免疫细胞群，这与它们的无血管状态一致。利用成对相关性分析，研究者发现不同肾单位细胞类型之间的高度相关，而间充质4与胎儿和成人间充质细胞类型之间的相关性较弱。
研究者使用免疫荧光（IF）染色验证了特异细胞类型标记基因（图2a–c）。在所有细胞系和实验方案中都检测到足细胞（WT1）、近端肾小管细胞（LTL）和远端肾单位细胞（CDH1）的标记基因，而仅在N2和ThF中可以检测到正在发育的输尿管芽（UB）标记基因GATA3的表达（图2c）。研究者还验证了特定细胞簇的标记基因：NPHS1（足细胞簇），与足细胞特异性标记基因突触足蛋白（SYNPO）共定位（图2d）；LRP2（近端肾小管细胞簇），与LTL（一种特定于近端肾小管的凝集素）共定位（图2e）；CDH1（远端肾小管区），标记基因的肾小管与LRP2/LTL阳性肾小管结构明显不同（图2e）。我们还通过IF染色验证了MEIS1（一种在肾间充质细胞中富含的基因），在该基因定位于间质组织，即层粘连蛋白（LAMA1）阳性基底膜结构外部的细胞空间（图2f）。
图2 IF验证了来自成熟肾脏类器官中单细胞测序数据的标记基因。
脱靶细胞导致细胞比例变异
为了进行更高级别的比较，研究者研究了四组：肾单位细胞、间充质细胞、脱靶细胞和内皮细胞（图3b）。肾单位细胞平均占所有细胞的16.7％（N1中为9.89％，ThF中为24.1％）。N1品系的EC平均相对比例最大（0.1％），而所有品系的平均值为0.05％。间充质细胞在AS中占所有细胞的82.8％，在N1类器官中占88.6％，但ThF仅占64.2％，N2仅占39.2％。脱靶细胞在不同iPSC品系中比例不同，从AS-1和N1中的1.6％到N2中的43.7％（图3b）。为了确定变异，再次计算了JSD（图3d）。肾单位细胞和间充质细胞是一致的（肾单位细胞平均JSD=0.05，sd=0.038；间质细胞平均JSD=0.07，sd=0.05），而脱靶细胞在不同品系之间和不同方案中是不同的（平均JSD=0.14，sd=0.09）（图3d）。N2类动物器官与AS的差异最大。值得注意的是，间充质细胞与肾单位细胞的比值与脱靶细胞的比值成反比（Spearman相关系数ρ=-0.84）。较高的脱靶细胞（N2，ThF：11.7％，JB-ThF：12.2％）导致较低的间充质与肾单位细胞之比（N2：2.29，ThF：2.66，JB-ThF：4.05），反之亦然（脱靶细胞-N1，AS：1.59％；间充质：肾单位-N1：8.96，AS：5.31）。相反，在成年和胎儿肾脏中，间充质细胞比例总体较低（成年为20.3％，胎儿第17周为19.7％），并且相对于肾单位细胞（成年为1.23，胎儿为0.47）较低。总而言之，研究者注意到iPSC品系之间的类器官异质性比品系中的重复之间或不同方案之间的异质性更大，而脱靶细胞贡献最大的变异。
D15出现细胞类型比例的差异
为了探讨iPSC品系相关差异是否与D0的基础状态或分化过程相关，比较了每种类器官在D0、D7和D15的单细胞转录谱。在D0时对来自四种未分化iPSC品系的42433个单细胞的分析（图3e，h）显示，在已识别的细胞簇中分布均匀，表明初始iPSC品系之间的一致性。为了确定是否存在朝特定发育胚层分化的细胞簇，研究者使用已知的三个胚层的转录标记基因对类器官进行了评分。结果没有观察到带有任何特定胚层标记基因的亚簇，也没有观察到准备分化的亚簇。四种细胞簇分别来自每个iPSC品系（平均JSD=0.05，sd=0.04，图3h，i）和所有不同的细胞周期阶段。
同样，在第7天，来自所有iPSC品系的正在发育的类器官表达了具有活跃增殖细胞的中胚层分化标记基因，并且品系间差异很小（图3f，h）。不同细胞比例差异很小（平均JSD=0.02，sd=0.01，图3i）。值得注意的是，细胞簇3、5和0分别表达了CTNNB1，SOX1和SOX2，WT1，这些基因在中胚层（IM）分化为后肾间充质（MM）或UB的过程中上调。研究者没有观察到D7类器官中的肾单位细胞类型。
在D15时，类器官具有NPC的多个亚型和广泛表达肾小管祖细胞标记基因（PAX2，LHX1）的上皮细胞群。在所有iPSC品系中，作者观察到了肾单位细胞的早期模式（通过近端（CUBN）和远端（MAL，WFDC2，POU3F3）标记基因的表达，正在增殖的细胞群（例如，间充质4细胞簇表达的CTNNB1、PTPRS、CDC42和SOX11，类似于iPSC和D7类器官中表达CTNNB1的细胞），还有足细胞样细胞的不同亚型（图3g，h）。与D7和D0（图3i）相比，iPSC品系之间的成分存在显著差异（平均JSD=0.14，sd=0.07；图3g，h，i）。肾单位样细胞的比例在AS中为0.08％，在N2的D15类器官中为56.9％（图3h，j）。重要的是，我们还注意到内皮祖细胞的异质性（与D29类器官一致），N1的平均相对比例最高0.32％（在其他品系中为0.05％；图3j）。
虽然在D15未发现明显的脱靶细胞，但N2和ThF类器官在间充质细胞中有一小部分表达SOX2的神经元祖细胞。N2和ThF的D15类器官中的间充质：肾单位比值也较低（图3j）。因此，在D15时具有较高肾单位细胞比例的类器官拥有独特的SOX2+细胞，并继续在D29产生更高比例的脱靶细胞，进而与D29较低的间充质细胞与肾单位细胞之比相关（图3b，j）。此外，研究者对来自所有品系的D15类器官切片进行了SOX2的免疫荧光染色。发现SOX2蛋白在ThF和N2类器官（在D29中具有更多的脱靶细胞，图3b）中可检测到，但在AS和N1中（在D29中具有很少的脱靶细胞）可忽略不计。因此，作者得出结论，D15的SOX2表达可能是类器官分化中变异性的来源。最后，对ThF品系进行了D0、D7和D15类器官的联合聚类分析。发现：（1）D0的细胞簇具有多能性标记基因（例如POU5F1，L1TD1）的特异表达；（2）D7的细胞簇具有高表达的中胚层标记基因（例如DKL1，HOXB9，HOXD1，HOXC8）；（3）D15有近端和远端肾单位细胞簇（例如近端：WT1，FOXC2，NOTCH2，远端：IRX3，JAG1，PAX2，PAX8，LHX1）；（4）共享的增殖状态（例如UBE2C，TOP2A，MKI67，CENPF）。总之，由D15检测到的脱靶细胞是类器官之间变化最大的种群。
图3 D15的scRNA-seq检测到细胞类型比例的变异。
类器官间的发育程序的一致
与成年肾脏相比，研究者检测了已知的转录因子（TFs）和参与肾发生的关键基因是否在来自四种不同iPSC品系的类器官中的各个细胞簇中表达。总体而言，在不同的iPSC衍生的类器官间，关键的发育程序在预期的时间点和过渡阶段表达（图4a）。首先，核心多能性TFs在iPSC阶段表达，并随后降低（D7-D29）。值得注意的是，神经元祖细胞标记基因SOX2再次出现在脱靶神经元细胞的D29类器官中（图4a）。其次，在D7，即CHIR脉冲之前（图1a），所有细胞簇中的细胞都具有中胚层发育标记基因（如HAND1和HOX11基因）的高表达。D7到D15之间的类器官会成形，来自D7的IM诱导基因在D15中下调，而肾单位祖细胞基因以肾单位细胞特异性的模式上调：上皮细胞簇中的JAG1、LHX1、PAX2、PAX8，肾单位祖细胞和足细胞样细胞中的WT1（图4a）。在D15的时候，首先观察到了在D29中SOX17阳性内皮祖细胞（图4a）。肾单位细胞模式在D29时变得更加明显：FOCC2和WT1在足细胞中高度表达，而IRX3和POU3F3具有明显的远端表达模式（图4a）。
在D15足细胞中富集的几个标记基因（CTGF，CLDN5，SOST，SPARC；图4b），研究者验证了D15类器官的肾素（NPHS1）和WT1阳性足细胞的CLDN5蛋白（claudin 5，一种控制许多细胞紧密连接的整合膜蛋白）（图4c）。为了验证D15类器官的分析鉴定的内皮前体细胞，对SOX17进行了染色（定位于EC核），结果显示它与经典的内皮标记基因CD31共定位（图4d）。
图4 来自四种人iPSC品系的类器官的发育程序一致。
与疾病相关基因的组织区域特异性表达
为了评估来自不同iPSC品系的肾脏类器官在遗传性肾脏疾病研究中的应用，研究者鉴定了导致先天性肾脏和尿道异常（CAKUT）、遗传肾囊性（HRC）疾病和遗传性肿瘤综合征的基因的表达（图5a，b），以及慢性肾脏疾病（CKD）和孟德尔肾小球疾病的全基因组关联分析（GWAS）基因的表达。
来自所有品系的类器官在至少一个组织区域中可重复地表达与进行性肾脏疾病（包括成人发作疾病）相关的基因。早在D7时，所有iPSC品系的发育类器官中都广泛表达了与胚胎和儿童早期异常相关的基因（CAKUT和HRC）。相对的，在成年肾脏中不存在类器官中富含的发育基因（例如RET，HPSE2）。一些基因在成熟类器官中以与成年肾脏中以相似的模式表现出高水平的表达和细胞类型特异性表达。例如，PTPRO（来自GWAS的CKD和单基因肾小球疾病）在D29和成年人类足细胞中表达。同样，PAX2和MUC1（分别来自CAKUT和囊性疾病）在D29远端肾小管中高度表达，类似于它们的人类成年中的表达模式（图5a，b）。研究者通过IF染色验证了scRNA-seq分析的这些标记基因，证实了成熟类器官切片中CDH1+远端肾小管上皮细胞中PAX2和MUC1的共表达（图5c）。总之，来自四种不同iPSC品系的肾脏类器官可以作为人类肾脏组织合理可靠的替代品，用于研究各种肾脏疾病。
图5 与肾脏疾病相关的基因在来自四种人类iPSC品系的类器官的预期区域组织中表达。
小鼠体内的类器官移植减少了脱靶细胞
为了提高类器官的整体质量，研究者寻求减少脱靶细胞的方法。首先，对第32天（D32）和第51天（D51）体外生长的类器官scRNA-seq进行评估，发现延长类器官体外培养（长达51天）不会减少脱靶细胞的比例（图6a，b）。D32和D51类器官具有与D29类器官相似的细胞群，包括肌肉、神经元和黑色素瘤脱靶细胞。注意到在D29、D32和D51中有两个神经元脱靶细胞簇：STMN2+神经元样细胞（D29，D32）和SOX2+NTRK2+神经元前体细胞（D29，D32，D51）。
肾脏发育需要来自相邻脉管系统的信号传导，但是体外生长的类器官中的EC极少（图1c和3a）。更短地暴露于CHIR或外源添加VEGF可以增加体外的EC细胞群，但是这些EC并未侵入肾小球囊。免疫缺陷小鼠肾囊下的类器官移植使小鼠EC浸润到移植的肾脏类器官中并促进血管形成。然而，迄今为止，尚未以单细胞分辨率研究移植的类器官。
将D18和D25类器官（ThF系）移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下，D18在移植后14天恢复（D32类器官移植），D25在移植后26天恢复（D51类器官移植），并通过scRNA-seq对它们进行了分析，并以体外培养的D32类器官作为对照。由于技术原因，从D51类器官移植获得了较低的单细胞产量。通过组合参考基因组的比对将人类与小鼠细胞区分开，并确认D32移植的人类肾单位细胞对应于D29肾单位细胞。证实D51移植的人类器官被小鼠EC血管化：IF显示小鼠Plvap阳性EC与人足细胞（NPHS1）结合（图6c）。小鼠软细胞组织中存在一些人类细胞核，这表明人类细胞侵袭到小鼠组织中。
为了在分子水平上获得更多的机理见解，研究者进行了受体-配体分析。结果表明VEGFA和ANGPT1在足细胞中表达最高（图6d）。在小鼠Plvap+EC中VEGF受体Flt1、Kdr和Flt4以及血管生成素受体Tie1表达最高（图6d），表明这些细胞类型可以相互作用。此外，来自移植类器官的肾小管上皮细胞的KLF6（参与UB和CD发育的TF）和Notch效应因子HES1（MAL+远端肾小管中对肾生成的近端至远端模式中起作用）的表达上升（图6e）。这些上调的基因表明，与体外D32、D29或D51对照相比，来自D32移植的类器官的远端肾小管细胞的成熟状态增强。
令人惊讶的是，与对照相比，研究者发现在D32移植的类器官中几乎没有脱靶的SOX2（神经元前体细胞）或PMEL（黑色素瘤细胞）表达。这表明移植减少了脱靶细胞（图6f）。MYOG阳性肌肉细胞存在于D32移植的类器官中（图6f）。还注意到，罕见的STMN2+神经元细胞簇存在于D32移植中。该细胞簇与胎儿肾脏第17周的神经元细胞簇高度相关（Spearmanρ=0.82；图1f），表明这些STMN2+细胞不是真正的脱靶细胞。该细胞簇在人类胎儿肾脏与D32移植的类器官之间共享了一组基因（GAL，CHGA，CHGB）。CHGA和CHGB在D29对照类器官的STMN2+簇内的少量细胞中也可检测到，这表明移植选择并促进了这个靶向的STMN2+/CHGA+/CHGB+簇。应用算法进一步评估了移植类器官中所有细胞簇与体外生长的类器官之间的关系（图6g）。没有移植的类器官细胞对应于SOX2+NTRK2+神经前体或PMEL+黑色素瘤样细胞（图6g）。与这些发现一致的是，与对照组中的许多SOX2阳性细胞相比，IF染色显示D32移植的类器官中的SOX2染色减少（图6h）。因此，作者推测移植消除了SOX2+神经元和PMEL+黑色素瘤的脱靶细胞，并可能促进了类器官成熟向更高级的类人状态发展。总而言之，这些数据表明移植减少了脱靶细胞，提高了类器官的质量。
图6 将人类动物器官移植到小鼠中可减少脱靶细胞。
讨论
在这项研究中，与人类成人和胎儿肾脏相比，研究者提供了在单个细胞分辨率下的人类肾脏类器官的全面研究，涵盖多个iPSC细胞品系、时间点、实验方案和实验重复性，还包括移植到小鼠中的共450118个细胞。该分析为有关类器官可重复性、可靠性和质量的几个关键问题提供了重要基础。
首先，作者以单细胞分辨率比较了源自四种人iPSC品系的肾脏类器官。在这项研究中，在不同条件下对大量细胞和实验重复进行测序，为科研人员提供了研究多种细胞类型的机会，并进行了大量的统计，例如JSD分析，获得了对类器官可重复性的定量见解。通过与成人和胎儿的人类肾脏进行比较，从所有四种iPSC品系的D29类器官中鉴定出主要的肾单位细胞。足细胞和PT细胞发育良好，而远端肾小管细胞分化程度较低。在单细胞分辨率下，发现iPSC本身具有相当的多能性（D0），并且在D7处具有适度的可变性。但是，D15类器官显示出更大的细胞比例变异，并且具有独特的SOX2+细胞，这表明成熟的D29类器官的变异很可能源自D7到D15时类器官发育时的脱靶作用。然后脱靶区域驱动的D29维持了细胞组成的变异模式。重要的是，在D15时具有较高NPC比例的类器官继续在D29发育出更多的脱靶细胞。数据表明，未来改进类器官实验应集中在D7和D15之间的时间间隔，以减少祖细胞的持久性及脱靶细胞的发育。
其次，数据表明来自四种不同iPSC品系的肾脏类器官可以作为人类肾脏合理可靠的替代品，用于研究多种肾脏疾病。例如，作者验证了D29类器官的远端管状区域中MUC1的表达。MUC1的突变是常染色体显性肾小管间质性肾脏疾病的病因，这种罕见的肾脏疾病无法治愈。对患者iPSC衍生类器官机制的研究可能会大大受益于寻找遗传疾病的治疗方法。本研究为朝这个方向的研究提供了重要的基础，源自各个患者的类器官实际上可以用作促进生物学发现和治疗的工具。因此，在尝试对来自不同患者的iPSC衍生的肾脏类器官进行有意义的比较时，本研究可以作为有价值的参考。
最后，研究者针对脱靶细胞解决了类器官质量的关键问题。最近的报道集中在通过使用NTRK2阻滞剂从肾脏类器官中消除神经元脱靶细胞。但是，NTRK2不仅在脱靶神经元细胞中表达，而且在胎儿肾脏和发育的类器官足细胞中大量表达，NTRK2阻滞剂可能产生对足细胞分化和功能的不利影响，这引起人们的担忧。本研究确定了类器官移植是减少脱靶细胞的另一种方法。在小鼠肾囊下移植减少了SOX2+神经元前体细胞和PMEL+黑色素瘤细胞。此外，发现了移植类器官选择和促进了靶向STMN2+/CHGA+/CHGB+簇，这表明脱靶细胞的消除也可能有益于类器官的成熟。未来的研究应检测早在D7的类器官移植是否可以消除脱靶细胞并增强类器官的形成，特别是UB和CD的发育。最新研究的改良方案也支持了移植的优势，该方案一方面实现了体外EC细胞群的增加，但另一方面发现，除非将EC移植到肾小球囊中，否则EC不会侵入肾小球囊。因此，就目前而言，类器官移植是用于血管化和去除脱靶细胞的可靠方法。尽管此方法的低通量使其在最初的药物筛选中不实用（在体外使用可能是最佳的方法），但作者推测，未来对于移植和血管化类器官中先导化合物的研究，将为有关化合物功效、人肾细胞的代谢以及肾脏特有的毒性提供有价值的数据。
评论
总之，本研究对iPSC衍生的肾脏类器官提供了深入的见解，阐明了它们的可重复性，指出了变异的来源，并表明移植可以减少脱靶细胞。利用scRNA-seq技术得到的全面的研究数据将成为科学界的基础资源，从而为肾病患者治疗方法的发展提供动力。
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