导读
特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性肺部疾病，其特征是远端肺部不可逆转地形成疤痕组织，导致呼吸衰竭和死亡。本研究利用scRNA-seq在单细胞水平上揭示了IPF中异常细胞群的复杂性和多样性。在IPF的上皮细胞中，发现了一个未被鉴定的异常基底细胞群，位于IPF肺中肌成纤维细胞病灶的边缘，且共同表达基底上皮、间充质、衰老和发育标志。在血管内皮细胞中，发现了一个在转录上与IPF中支气管限制性血管内皮细胞完全相同的异位扩张细胞群。进一步通过免疫组化和独立的数据集证实了这两个群体的存在。在基质细胞中，发现IPF肌成纤维细胞和侵袭性成纤维细胞在正常和COPD肺中部分重叠。最后，研究证实了先前在IPF肺中发现的嗜酸性巨噬细胞群。
原名：Single-cell RNA-seq reveals ectopic and aberrant lung-resident cell populations in idiopathic pulmonary fibrosis
译名：单细胞RNA-seq揭示特发性肺纤维化中异位和异常的肺驻留细胞群
期刊：Science Advances
IF：12.804
发表时间：2020.7
通讯作者：Ivan O. Rosas, Naftali Kaminski
通讯作者单位：哈佛医学院，耶鲁医学院
DOI号：10.1126/sciadv.aba1983
本研究从32个IPF肺（45个文库，产生147,169个细胞），18个慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺（24个文库，产生69,456个细胞）和28个对照供体肺（38个文库，96,303个细胞）中获得了312,928个远端肺实质样本的细胞（图1A）。基于不同的标志确定了38种离散的细胞类型（图1B&1C），进行后续分析。研究数据已保存在Gene Expression Omnibus（GEO）（GSE136831），可通过IPF Cell Atlas数据挖掘门户（www.ipfcellatlas.com）检索。
1.纤维化肺的上皮细胞群发生明显改变，并含有异常的基底细胞
研究者首先在正常组织中鉴定了所有已知的肺上皮细胞种群，包括1型肺泡（AT1）和2型肺泡（AT2）细胞，纤毛细胞，基底细胞，杯状细胞，俱乐部细胞，肺神经内分泌细胞和离子细胞。IPF肺的上皮细胞群表现出气道上皮细胞比例增加，且肺泡上皮细胞明显降低的特征（图2A&2B）。更重要的是，与对照组及COPD组相比，本研究所鉴定的几乎所有上皮细胞在IPF肺中都表现出明显的基因变化。在上皮细胞中，研究者鉴定出了先前未曾发现的异常基底细胞群（其转录特征不同于任何先前已知的上皮细胞群），除了上皮标记，这些细胞还表达基础细胞标记（如TP63，KRT17，LAMB3和LAMC2），但不表达其他已知的基础标记（如KRT5和KRT15）（图2C）。此外，这些细胞还表达上皮-间质转化（EMT）标记（如VIM，CDH2，FN1，COL1A1，TNC和HMGA2），与衰老相关的基因（如CDKN1A，CDKN2A，CCND1，CCND2，MDM2和GDF15）（图2C，右），并且高表达已建立的IPF相关分子（如基质蛋白酶7，MMP7）。当评估其转录因子富集基序时，这些细胞表现出较高的下游SOX9激活的转录活性，SOX9是对远端气道发育和修复至关重要的转录因子（图2C，右上）。鉴定出的483个异常基底细胞中，448个来自IPF肺，而33个来自COPD肺部，占IPF所有上皮细胞的3.5%，而COPD为1.1%。研究者使用p63、KRT17、HMGA2、COX2和p21作为标记物，通过免疫组织化学（IHC）验证了这些细胞的存在，且定位在IPF肺（图2D）。在IPF肺中，这些细胞定位于覆盖肌成纤维细胞病灶的上皮层。为了独立验证此结果，研究者重新分析了Reyfman等人发表的IPF单细胞数据，观察到数据集之间异常基底细胞的相关性比数据集内不同上皮细胞类型的相关性更大，从而证实了此结果（图2E）。
图2. IPF和COPD肺中异常细胞的鉴定
2. IPF肺的内皮细胞群包含异位支气管周内皮细胞
尽管在IPF肺中长期注意到血管内皮的变化，但对其细胞和分子特征了解甚少。血管内皮（VE）细胞的聚类分析揭示了四类易于表征的细胞群（毛细管A,B，动脉或静脉内皮细胞群）。第五种VE群因其表达COL15A1而最突出（图3，A至C）。因IHC显示COL15A1 + VE细胞限存于邻近主要气道的脉管系统，将这些细胞称为支气管周内皮细胞（pVE）。尽管在所有疾病的患者中都发现了pVE，但与对照组或COPD相比，它们在IPF患者的整体VE组成中占比最高（图3C）。使用内皮标记物CD31和COL15A1对pVE进行定位，结果表明，在对照组肺中它们局限于邻近主要气道的脉管系统；在IPF肺的支气管化和纤维化区域观察到大量的COL15A1 + CD31 + VE细胞（图3D）。重新分析包含正常气道和肺实质样本的scRNA-seq数据集，证实在远端肺血管内皮细胞中未观察到pVE特异的基因（图3E）。这些结果共同表明，COL15A1 + VE细胞代表IPF远端肺中的异位pVE细胞群。
图3.鉴定出疾病状态下富集的血管内皮细胞群
3. IPF肺在成纤维细胞和肌成纤维细胞中表现出疾病相关原型
为了表征IPF肺中的肌成纤维细胞和成纤维细胞，研究者首先关注具有PDGFRB表达特征的细胞群，然后去除具有平滑肌细胞或周细胞（RGS5和COX4I2）特征的细胞，因而帮助鉴定出两个基质群：成纤维细胞（表达CD34，FBN1，FBLN2和VIT）;肌成纤维细胞（表达MYLK，NEBL，MYO10，MYO1D，RYR2和ITGA8）（图4A）。虽然这些特征在IPF肺和对照肺的两个细胞群中一致（图4A&B），但IPF肺中包括一类成纤维细胞表型（富含纤维胶原和ACTA2）和一类成纤维细胞表型（HAS1，HAS2，FBN1和SHH诱导的趋化因子CXCL14表达增加）（图4B-D）。基于分区的图抽象（PAGA）谱系重建技术应用于两种细胞类型的亚簇（图4B），结果显示与成纤维细胞或肌成纤维细胞亚群的内部连通性相比，两类细胞表型之间的空间连通性相对较弱（图4B，下）。每种细胞类型内的细胞无监督伪时间排序会导致IPF肺的细胞在每个流形远端富集（图4C-E）。这些细胞原型的跨主体IPF富集分析表明肌成纤维细胞具有较高的显著性，但成纤维细胞仅具有微弱显著性。扩散伪时间（DPT）距离与基因表达之间Spearman相关性分析显示在IPF的每个流形边缘，激活的肌成纤维细胞（图4D）或侵入性成纤维细胞（图4E）相关基因的表达逐渐增加。总之，这些结果表明在成纤维细胞和肌成纤维细胞内同时发生趋向IPF原型的连续变化。
图4.IPF肺中成纤维细胞和肌成纤维细胞原型分析
4. 纤维化巨噬细胞原型掩盖了IPF肺部免疫全貌
研究者在不同疾病条件的多个受试者样本中确定了18种不同种类的免疫细胞（图5A）。与对照组相比，IPF中朗格汉斯树突状细胞和调节性T细胞的比例升高（图5B）；然而这些差异没有达到显著性。本研究观察到的IPF特异性巨噬细胞与之前的报道相似。为进一步阐明这些细胞的特征，研究者采用三元模式对经典单核细胞、促纤维化IPF巨噬细胞原型和主体特异性的、炎症巨噬细胞原型进行分析（图5C-E），如前人研究所述，研究者观察到当不断接近IPF巨噬细胞最末端时，相关特征的变化会逐渐趋向IPF巨噬细胞原型（图5D&5E），SPP1和胆固醇酯酶脂蛋白酶和LIPA的表达沿变化轨迹相对较早地稳定增加，ECM重塑基因SPARC，GPC4，PALLD，CTSK和MMP9的表达沿流形进一步增加。在IPF原型的末端，巨噬细胞开始表达CSF1，这表明可能存在介导招募和激活的自分泌反馈回路。
图5.免疫分析证实IPF肺中纤维化巨噬细胞原型
5.IPF肺基因调控网络与正常对照组显著不同
研究者运用基因调控网络（GRN）推理方法bigSCale，以更好地了解IPF肺部细胞调控网络的变化（图6A）。IPF的GRN拓扑结构显示出较高的密度，这反映在基因-基因关系和模块化上，也反映在社群内联系多于社群间的联系（图6B）。通过比较组成GRN的细胞对社群的贡献，发现对照组GRN在社群内和跨社群都显示出相对多样化，这与非纤维化肺的器官功能一致。在IPF的GRN中，主要的上皮相关社群在很大程度上有别于调控网络的其它部分，其中的最高密度社群主要由异常基底细胞驱动（图6C）。为了评估两个调控网络之间差异的生物学相关性，研究了描述其拓扑的主要区别变量。利用PageRank中心度衡量基因对调控网络的影响，与对照组GRN相比，研究者确定出了按PageRank差异排名的前300个有影响的基因（图6D）。这些基因的基因集富集对应了许多生物学特征，包括细胞老化、衰老、对TGFB1的反应、上皮管腺的形成以及平滑肌细胞分化，这些与当前已知的机制一致（图6E）。这些发现强调了异型细胞对于IPF分子畸变中许多关键过程的推动作用。
图6.IPF和正常肺的GRN分析
本研究全面、详尽地描述了IPF上皮细胞概况，更好的了解“支气管化”（IPF肺部病理学术语）所涉及的细胞机制。气道基底细胞作为气道上皮细胞祖细胞在肺发展至关重要，本研究以及前人研究均表明在IPF肺部发生重塑的区域气道基底细胞丰富，并且预示较差的后果。但如果使用有限的标记组合，可能会使一群异常的基底细胞与气道基底细胞混淆。此类异常基底细胞是非常罕见的细胞群，具有独特的特征。因此，这些细胞的鉴定为IPF肌成纤维细胞灶表面发现的单层立方上皮细胞研究提供关键思路。因这些细胞获得了间质特征而失去一些上皮特征，一直存在争议，不过这也提示其活跃的EMT特性。本研究表明，肌成纤维细胞灶由一层异常的基底细胞排列组成，且这些细胞表现出EMT特性能够通过其整合素激活TGFB1，虽然部分衰老仍保持祖细胞特征。虽然不可能完全确定该细胞群的起源，但它与驻留的肺泡上皮细胞群不同，可能源自稀有的祖细胞群。此外，研究者发现肌成纤维细胞灶本质上是基底细胞样细胞，IPF肺中规则的气道基底细胞的扩张将IPF成纤维细胞灶和蜂窝状囊肿这两个最明显的组织病理学特征结合在一起，形成独特的共同点，即远端肺中具有近端气道上皮特征的细胞的表现。对IPF肺中VE细胞群的分析得到一个意想不到的结果。IPF肺中血管重构通常集中发生在肺毛细血管替代区(由纤维母细胞病灶的非血管斑引起)，对血管生成的潜在变化还不确定。肺VE细胞鉴别标记的缺乏和细胞培养的困难限制了对IPF血管重构的研究。研究者在IPF肺中发现了一个扩增表达COL15A1的VE细胞群，在转录上与对照组肺中支气管细胞没有区别。免疫组化显示，这些细胞存在于IPF远端肺受影响的实质区。公开数据集分析显示正常肺中的这些细胞局限于支气管周围血管，在肺实质中并不存在。这可能为IPF肺中支气管血管网络扩张提供细胞分子基础。目前无法明确pVE细胞异位是否参与IPF临床表现的发病机制，但这一新发现强调了IPF肺血管内皮研究的重要性。IPF肺表型一个重要的特点是成纤维细胞激活和肌成纤维细胞聚集。尽管在体外或疾病动物模型中，对驱动成纤维细胞纤维化的分子和代谢变化的研究取得了显著进展，但对IPF肺中细胞群体的多样性知之甚少。本研究分析表明病理性的表达ACTA2的IPF肌成纤维细胞不是离散的细胞类型，而是与静止的ACTA2阴性基质群相连的连续细胞群。该种群始终表达肌肉相关基因，如MYLK，NEBL，MYO10和MYO1D，这表明IPF中观察到的病理表型是该细胞群扩展的疾病相关特征，而不是离散细胞种群转分化的结果。本研究中，所有单细胞组织实验固有的分离偏差可能导致细胞分布的虚假变化，并限制了对病理状态下对细胞群体变化的精确数字描述。针对上述问题，研究者使用了几种策略，首先所有样本的处理方式完全相同，从远端肺中获取，并设计一个专门利于分离组织储存的分离方案，提高活力和可重复性。使用储存的组织还允许研究者同时运行多个样本，最大限度地减少批量效应。第二种方法是使用多种验证方法（详细的免疫组化验证和对不同数据集的再分析）。另一个重要的局限性是难以区分瞬时细胞状态和不同的细胞群。研究者利用最先进的算法和免疫组化方法来确保研究得到结果代表了存在于IPF肺中的细胞实体，但在现阶段未能确定这些细胞是否参与了IPF发病机制或临床表现。另一个重要的限制是使用肺移植患者的移植组织。这些组织代表疾病的末期，而不是早期。为了控制终末期肺病的影响，研究者使用了COPD患者的移植肺，进而排除终末期肺的非特异性影响。这有助于IPF成纤维细胞群、变异的pVE细胞和IPF中上皮细胞的细支气管化分析，但对于异常的基底细胞并没有明显的帮助。
