编译：Mr.Left，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
酸雨是一个广泛的环境问题，严重影响农作物的正常生长。褪黑素是众所周知的多效性分子，其通过生理和分子介导提高植物的非生物和生物胁迫耐受性。然而，从未研究过外源褪黑素对植物在酸雨条件下分子活性的影响。本研究的目的是揭示外源褪黑素在番茄抵抗酸雨胁迫的生理和分子变化中的可能作用。通过RNA测序分析的转录组图谱确定了对照植物（Ctr）与模拟酸雨胁迫植物（P25）比较组，对照植物与模拟酸雨胁迫后褪黑素处理的植物（P25M）比较组和P25与P25M的比较组中的1228、1120和1537差异表达基因（DEG）。其中，在所有比较中共表达152个DEG，且均观察到次级代谢物相关基因的表达。而且，在所有处理比较中，ERF，WRKY，MYB和bZIP等相关基因的转录本家族占更多。RNA测序和qPCR结果表明，外源褪黑素与酸雨胁迫减缓剂密切相关，可能与DEG的改变，植物次级代谢物的生物合成和编码转录因子的基因表达有关，这可能对有害环境条件有潜在的应用。
原名：Melatonin-mediate acid rain stress tolerance mechanism through alteration of transcriptional factors and secondary metabolites gene expression in tomato
译名：褪黑素通过改变番茄的转录因子和次级代谢物基因表达介导的酸雨胁迫耐受机制
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872
发表时间：2020.05
通讯作者：邱栋梁
通讯作者单位：福建农林大学
DOI号：10.1016/j.ecoenv.2020.110720
1 生长和发育的变化
为了揭示褪黑素介导的酸雨胁迫耐受机制，首先，作者在以前的实验中观察了生长和生理变化。实验结果（表1）表明，模拟酸雨处理显著降低了番茄的光合作用活性，生长参数，如株高，枝叶重，叶片数和茎围，并且模拟酸雨处理破坏了细胞的超微结构，而100 μM褪黑素的应用显著改善了细胞的超微结构。值得注意的是，通过模拟酸雨处理增加了过氧化氢和丙二醛的积累，而施用100 μM褪黑素通过增加ROS清除酶和非酶的活性，显著降低了过氧化氢和丙二醛的积累（表1）。如图1所示，由于进行了模拟酸雨处理，番茄叶片出现可见的斑点，并通过施用100 μM褪黑素将其恢复。这些生长和生理结果表明，外源褪黑素对番茄植株的酸雨胁迫耐受性具有重要作用。
表1 在酸雨和褪黑激素处理下，番茄幼苗的生长和生理活性的变化。
注：Ctr，P25和P25M分别表示对照，分别用pH 2.5的模拟酸雨和pH 2.5的模拟酸雨及褪黑素处理。Fo，Fv/Fm，H2O2，MDA，APx，POD，CAT，SOD，FRAP和FW分别表示质体醌电子受体池被完全氧化时的最低荧光水平，光系统II的最大量子效率，过氧化氢，丙二醛，抗坏血酸过氧化物，过氧化物酶，超氧化物歧化酶，三价铁还原抗氧化能力和叶片鲜重。数据在此表示四次重复的平均值。±表示标准误差。根据Turkey's检验，在各个参数中不具有相同字母的均值在P ≤ 0.05处有显著差异。
图1不同处理条件下的可见斑点。Ctr，P25和P25M分别表示对照，分别用pH 2.5的模拟酸雨和pH 2.5的模拟酸雨及褪黑素处理。通过Labchip GX检测了从对照，模拟酸雨胁迫和模拟酸雨处理后褪黑素处理植物收集的叶片样品中分离出的总RNA的质量。所有样品的rRNA 28 S：18 S比率在2.12和2.18之间，RNA质量得分在6.4和7.4之间，并且A级质量检查符合cDNA文库构建和Illumina测序的前提（补充表2）。每个样品的RNA测序长度约为150 bp。去除杂质或低质量片段后，在对照，模拟酸雨胁迫和模拟酸雨胁迫并用褪黑素处理下的Micro-Tom番茄叶片中，确定了99.00％–99.40％的高质量片段和0.03％的错误率并用于进一步分析（补充表3）。使用Hisat2将高质量片段映射到参考序列，并评估比对结果，以实现二级质量控制并确定参考是否合理。比对后，在褪黑素处理的对照，模拟酸雨胁迫植物和模拟酸雨胁迫后用褪黑素处理植物中的独特映射片段中有82.55％–83.23％，83.69％–83.72％和82.46％–84.16％的高质量片段，多重映射片段中分别有11.94％–12.62％，11.38％–11.67％和11.33％–11.55％的高质量片段（补充表3）。此外，结合参考序列注释文件，计算了映射到参考基因组的片段数量，包括外显子，内含子和基因间区域。与Hisat2参考序列注释相比，外显子区域占对照植物，模拟酸雨胁迫处理植物和模拟酸雨处理后褪黑素处理植物独特片段的88.04％–88.22％，87.47％–88.31％和86.63％–87.93％，内含子区域占4.56％–4.73％，4.23％–4.79％和4.75％–4.79％，基因间区域占7.21％–7.31％，7.45％–7.74％和7.3％–8.57％（补充表3）。火山图用于显示基因差异表达的总体情况。火山图表明了DEG的整体分布。从两个方面解释了DEG的差异和显著水平。对照和模拟酸雨胁迫植物叶片相比，上调了182个基因，下调了1046个基因，而17486个基因则没有差异表达（图2A）。相反，对照和模拟酸雨相处理后褪黑素处理植物相比，在18721个差异基因中有480个基因被上调，而640个基因被下调，而17601个基因则没有差异表达（图2B）。此外，模拟酸雨胁迫处理与模拟酸雨胁迫后褪黑激素处理相比较时，1158个基因被上调，379个基因被下调，18662个基因没有差异表达（图2C）。然而，当进行组间比较以观察差异表达的独特基因的重叠关系时，在Ctr vs P25，Ctr vs P25M和P25 vs P25M比较中分别表达了328个基因，267个基因和576个基因（图2D）。另一方面，在Ctr vs P25和Ctr vs P25M，Ctr vs P25和P25 vs P25M和Ctr vs P25M和P25 vs P25M的比较之间分别共同表达了320个基因，428个基因和381个基因（图2D）。此外，在所有三个组中共同表达了152个基因（图2D）。
图2 A-C图分别显示了Ctr vs P25，Ctr vs P25M和P25 vs P25M的差异表达基因（DEG）火山图。红点（上调）和绿点（下调）表示了显著的DEG。但是，蓝色表示的基因的表达没有显著差异；横轴表示不同样品或条件下表达倍数变化的基因；纵轴代表DEG的数量，其变化也具有统计学意义。D Venn图显示了每个比较组中DEG的数量，以及组之间的重叠关系。每个大圆圈中数字的总和表示比较组中DEG的总数，圆圈的重叠部分代表不同组之间共有的DEG。Ctr，P25和P25M分别表示对照，分别用pH 2.5的模拟酸雨和pH 2.5的模拟酸雨及褪黑素处理。基因本体论（GO）被称为通用基因功能类别系统，其受控词汇不断更新。GO具有三种本体论，例如分子功能，细胞组分和生物学过程。功能的GO富集分析提供了GO功能词条，与基因组背景相比，GO功能词条在差异表达的基因中显著富集，从而在差异表达的基因和生物学功能之间提供了明确的相关性。在此分析中，作者将DEG中的30个亚类显著富集到了GO数据库中（图3A–C）。在Ctr vs P25比较的DEG中，分别将28.85％，46.34％和24.81％分到了生物过程，细胞组分和分子功能中（图3D）。而在Ctr与P25M比较中观察到的这些值分别为44.90％，42.87％和12.23％，在P25与P25M比较中观察到的分别为33.51％，51.96％和14.53％（图3D）。
图3 A-C图显示的直方图直观地反映了在比较组中的遗传变异数量分布中GO术语的生物学过程，细胞成分和分子功能的富集。校正后的P值≤ 0.05设置为GO术语富集的条件。纵轴表示GO术语信息，横轴表示每个术语中富集的基因数。D图显示了比较组中GO类别的组装的差异表达基因（DEG）。Ctr，P25和P25M分别表示对照，分别用pH 2.5的模拟酸雨和pH 2.5的模拟酸雨及褪黑素处理。在生物学中，不同的基因协调并行使其生物学功能，而通路分析则显示了基因的生物学功能。KEGG是通路的主要公共数据库。使用KEGG通路作为一个单元进行通路显著性富集分析，应用超几何检验来发现与整个基因组背景相比在DEG中表达性富集的通路。通常，校正后的P值≤ 0.05表示DEG在KEGG通路中显著富集。散点图用于显示KEGG通路富集结果中DEG的前20个统计数据，如图4A–C所示。另外，通过富集因子和Q值计算KEGG通路中DEG的富集。富集因子是指在通路中富集的DEG与注释到通路中的物种基因之比。较高的富集因子表明富集程度更高。Q值是经过多重假设检验后的校正P值，Q值在0到1的范围内，接近0表示更显著的富集（图4A–C）。在Ctr与P25的比较中，在代谢途径，次级代谢物生物合成，植物-病原体相互作用和植物激素信号转导中观察到的KEGG途径中富集的DEG数量最多，而在Ctr与P25M的比较中，次级代谢物的生物合成，其次是植物-病原体相互作用和植物激素信号转导的数量最高（图4A和B）。然而，在P25与P25M的比较中观察到了DEG的KEGG通路富集的相似趋势（图4C）。此外，在次级代谢物生物合成途径富集DEG中，Ctr vs P25，Ctr vs P25M和P25 vs P25M比较中，分别上调了14.37％，33.03％和74.85％的基因，下调了85.63％，66.97％和25.15％的基因（图4D）。
图4 A-C图显示在不同处理比较中差异基因表达的途径富集。纵轴代表通路的名称，横轴代表富集因子，通路中点的大小代表DEG的数量，点的颜色对应于Q值的不同范围。D图显示了用于次级代谢物基因富集的DEG的数目。Ctr，P25和P25M分别表示对照，分别用pH 2.5的模拟酸雨和pH 2.5的模拟酸雨及褪黑素处理。在不同的处理比较中，DEG的不同转录因子不同（补充表4）。在对照和模拟酸雨处理的番茄幼苗对比组中，发现31种转录因子家族蛋白，其中包含151个TF基因，DEG中转录因子数量最多的是ERF，其次是WRKY，NAC，TCP，类G2，C2H2，bHLH和MYB家族蛋白（补充表4）。在对照和模拟酸雨胁迫后褪黑素处理番茄幼苗的比较中，发现33个TF家族蛋白中发现了137个TF基因，DEG中的转录因子最大数量为ERF，TCP，MYB_相关，MYB，bHLH，ZF-HD，类G2和WRKY家族蛋白（补充表4）。此外，在模拟酸雨胁迫和模拟酸雨处理后褪黑素处理的番茄幼苗比较组中，在35个TF家族蛋白中表达了191个TF基因，其中ERF，TCP，WRKY，NAC，G2样，C2H2，bHLH和ZF-HD转录因子显示出更高的DEG（补充表4）。通过选择15个基因进行qPCR以确认RNA序列数据。在15个基因中，有11个与植物次级代谢物相关的基因（补充表5）和4个与胁迫响应性不同转录因子相关的基因，包括MYB家族蛋白（Solyc03g005570.2），WRKY家族蛋白（Solyc09g014990.2），ERF家族蛋白（Solyc03g093610.1）和bZIP家族蛋白（Solyc11g010250.1）（表2）。qPCR基因表达模式与RNA序列的转录组数据几乎相似（表2），表明转录组结果的一致性和可靠性。如表2所示，对照和模拟酸雨处理组中，所有选择的基因均被下调。相反，在对照和模拟酸雨胁迫后褪黑素处理的植物比较组中，15个基因中，植物次生代谢产物相关的6个基因（Solyc02g093230.2，Solyc02g087350.1，Solyc07g006890.1，Solyc12g096770.1，Solyc02g089610.1和Solyc08g005610.2），MYB转录因子基因（Solyc03g005570.2），WRKYY转录因子基因（Solyc09g014990.2），ERF转录因子基因（Solyc03g093610.1）和bZIP转录因子基因（Solyc11g010250.1）被上调，5个与植物次生代谢产物相关的基因（Solyc06g068650.2，Solyc10g083440.1，Solyc07g043460.2，Solyc02g093270.2和Solyc07g043500.1）被下调（表2）。最终，模拟酸雨胁迫和模拟酸雨处理后褪黑素处理的植物对比组中，显示12个基因被上调而3个基因被下调（表2）。这些结果表明qPCR分析中的基因表达与通过RNA测序完成的转录组分析互补并且非常稳定。因此，这些发现表明，与植物次生代谢产物和不同转录因子有关的基因分别对模拟酸雨胁迫植物和模拟酸雨处理后褪黑素处理的植物产生了响应。此外，外源褪黑素可能通过调节番茄中植物次级代谢物基因和胁迫响应不同转录因子相关基因而减轻酸雨胁迫。表2 通过RNA测序和qPCR分析在不同对比组中选择的15个基因的相对表达。Ctr，P25和P25M分别表示对照，分别用pH 2.5的模拟酸雨和pH 2.5的模拟酸雨及褪黑素处理。由于近年来空气污染水平的提高，酸雨已成为全球农业的主要环境威胁。作者以前对酸雨的一项研究表明，pH 2.5的模拟酸雨限制了番茄的正常生长和光合作用，并积累了过多的ROS，改变了番茄幼苗的酶促和非酶促抗氧化活性。另一方面，已经确定外源褪黑素通过刺激酶和非酶抗氧化剂的活性，以及直接清除ROS来恢复生长和光合作用进而提高胁迫耐受性。表1的结果表明，外源褪黑素通过促进番茄幼苗的光合作用和清除ROS的抗氧化活性，提高了对模拟酸雨胁迫的耐受性。在当前部分中，通过RNA测序分析进行的转录组研究探索了外源褪黑素可能参与了番茄幼苗在模拟酸雨胁迫条件下差异基因表达模式，植物次级代谢物相关基因的响应以及不同转录因子的表达。在本实验中，转录组分析显示与植物次级代谢物相关的差异基因和蛋白质的表达受模拟酸雨影响。另外，外源褪黑素在酸雨条件下改变了差异基因的表达和次级代谢产物相关基因。在当前的实验中，RNA测序和qPCR的结果均表明，对照和模拟酸雨胁迫番茄植株相比，模拟酸雨处理可降低不同的次级代谢物相关基因的表达（表2）。以前的研究同样发现酸雨处理改变了植物中的差异基因表达和次级代谢物相关的基因表达模式。相反，褪黑素在模拟酸雨胁迫植物中的应用触发了对照与模拟酸雨胁迫后褪黑素处理对比组和模拟酸雨胁迫与模拟酸雨胁迫后褪黑素处理对比组的二级基因表达的上调（表2）。当前结果的发现与许多以前的实验结果一致，即外源褪黑素通过上调不同代谢物相关基因的表达来增强植物的胁迫耐受性。大量的比较转录组分析确认了30多个TF家族基因，包括MYB，WRKY，ERF，bZIP对非生物胁迫的响应。转录组分析还确定了在对照与模拟酸雨胁迫对比组，对照与模拟酸雨胁迫后褪黑素处理对比组以及模拟酸雨胁迫和模拟酸雨胁迫后褪黑素处理对比组番茄幼苗的30个TF家族基因显示出显著差异，与其他结果一致。TF家族基因显示出与非生物胁迫相关的不同机制的特定表达。此外，不同的转录因子基因，例如MYB，WRKY，ERF，bZIP等，在胁迫信号转导中起着至关重要的调节作用，并参与了响应非生物胁迫的植物次级代谢物的生物合成。根据qPCR和RNA测序结果，与对照相比，模拟酸雨处理下调了MYB（Solyc03g005570.2），WRKY（Solyc09g014990.2），ERF（Solyc03g093610.1）和bZIP（Solyc11g010250.1）的表达（表2）。以前的研究还观察到在酸雨胁迫条件下拟南芥中这些基因的表达降低。相反，在Ctr vs P25M和P25 vs P25M比较中，这些基因的表达上调。这些结果表明褪黑素在模拟酸雨胁迫下的番茄幼苗中的施用导致胁迫响应转录因子基因的上调，从而提高了番茄幼苗对模拟酸雨胁迫的耐受性。还观察到外源褪黑素调节bZIP，MYB，WRKY，ERF等TF的表达，这促进了ROS清除酶编码基因的表达以改善非生物胁迫耐受性。与以前的结果一致，本研究的结果表明外源褪黑素可能通过调节番茄幼苗中DEG，次级代谢物相关基因和转录因子相关基因来增强模拟酸雨胁迫耐受性。因此，研究结果表明褪黑素可能通过调节酸雨条件下的生长，生理和分子活性而成为增强植物耐受性的有效方法。外源褪黑素介导的酸雨胁迫耐受性和解毒的推定机理图解见图5。
图5外源褪黑素触发的番茄植物耐酸雨胁迫的细胞机制概述。褪黑素具有两亲性，因此可以自由穿过细胞膜。褪黑素可以直接清除ROS，还可以增加抗氧化剂的水平来清除ROS，从而保护细胞免受损伤并提高耐受性。褪黑素会改变与酸雨胁迫有关的基因的表达。褪黑素调节胁迫响应转录因子和次级代谢物生物合成相关基因，以提高番茄植株的酸雨胁迫耐受性。总而言之，本研究首次揭示了外源褪黑素在番茄幼苗中通过改变DEG，次级代谢物和转录因子相关基因表达模式而对模拟酸雨胁迫的保护作用。本研究揭示了在酸雨胁迫再进行褪黑素处理后参与抗氧化剂激活，次级代谢物调节和广泛转录基因表达模式的基因。本研究中番茄植株对模拟酸雨和褪黑素处理的差异基因表达模式，次级代谢物相关基因表达变化和转录谱的结果可为研究人员在不久的将来鉴定酸雨胁迫抗性的分子机制，以及利用外源褪黑素抵御酸雨和其他非生物胁迫条件提供有利资源。
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