科研 | Global Change Biol：在全球草地生态系统中植物残体的微生物过程受多种养分的共同限制
编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。
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微生物处理未加保护的有机物输入物是土壤肥力、长期生态系统碳和养分吸收以及可持续农业的关键。本研究调查研究了多元素（氮，磷和钾+9种必须的大量和微量元素）添加对埋在四大洲21个草原的标准植物材料分解和生物化学转化的影响。
在生长季旺季，多种养分添加虽然微弱但是持续增加了植物残体的分解和生物转化，同时也增加了微生物胞外酶活性的变化。较高的年平均降雨和较低的年平均温度是较高分解速率的主要气候驱动因子，然而植物残体的生物化学转化与最湿季的温度负相关。在大多数冷，高降雨量的地方，养分增加了分解，表明在未来温暖并且干燥的施肥草地土壤中植物残体的微生物过程可能会受到潜在的限制。
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实验设计
这项研究是在21个全球分布的草原上进行的，它们是养分网络的一部分。研究地点涵盖多种草地类型：冻原草地、一年生草地、中草草地、山地草甸、农田、半干旱草地、矮草草地、高草草地和地中海草地。地点位于北美和南美、欧洲和大洋洲，横跨的平均降水量（203-1507mm/年）、年平均温度（-3.2到23.7°C）和纬度（52°S-69°N）的范围很广。
在随机区组设计中，每个局部实验设置包括N、P和K的全因子组合，加上九种必需的大量、微量元素（K+µ）添加，通常每个处理有三次（最多五次）重复。主要的次要大量和微量元素与K一起添加的是钙（Ca）、镁（Mg）、硫（S）、硼（B）、铜（Cu）、铁（Fe）、锰、钼（Mo）和锌（Zn）。N以尿素的形式添加，添加的速率为10 g N m-2 year-1，P以重过磷酸钙的形式添加，添加的速率为10 g P m-2year-1，K以硫酸钾的形式添加，添加的速率为100 g m-2 year-1，并与大量和微量元素混合添加（6% Ca、3% Mg、12% S、0.1% B、1% Cu、17% Fe、2.5% Mn、0.05% Mo和1% Zn）。N，P和K每年添加，然而混合的养分只在开始的时候添加一次。每个样方的大小为5 ╳5 m，分成4个2.5 ╳2.5 m的子样方。每个子样方进一步分成4个1 ╳ 1 m的样方，其中一个用于土壤取样。
在每个研究地点，使用Tea Bag Index (TBI) 评估了埋藏的植物残体的分解速率和生物化学转化速率。TBI是一种用来评估植物分解的方法，即在90天的培养期间内，使用两种市面上可买到的茶包（绿茶[更不稳定的基质]和红茶[更稳定的基质]）作为标准测试试剂盒。TBI使用茶叶质量的相对丢失计算（a）分解率（k）和（b）稳定因子（S）的指标。稳定系数基本上量化了绿茶在该过程的后期残留的比例，在该过程中，假设分解率可以忽略不计。S因子与土壤C库的稳定性相关联（Keuskamp et al., 2013）。然而，由于基质与土壤矿物之间缺乏物理相互作用，我们将其解释为绿茶基质的生化转化指标，而不是基质被呼吸和流失到大气中的碳。而且，尽管绿茶和红茶不能真实的代表研究草地的埋藏的植物残体的真实质量，但是TBI通过测量标准材料的分解和生物转化潜势充分呈现了分解环境。因此，它提供了分解过程早期和后期的标准化指标，这些指标对于不同地点和处理的直接比较至关重要。
绿茶和红茶的产品条形码编号分别是8722700055525和8722700188438，每个地点的每个样方都埋有金字塔形的尼龙网袋（8厘米深），埋藏90天。培养结束后，收集每个样方成对的茶包，并徒手清洗（不使用水），然后在60℃下烘干48小时，之后称重计算k和S，另外一对茶包立即在-20℃冷冻保存，带回实验室用于测定微生物胞外酶活性。
对部分分解的样品进行了与主要生物地球化学营养循环相关的七种酶的测定：（a）C循环的酶：α-和β-1,4-葡萄糖苷酶（AG和BG），木糖酶（XYL）和β-D-纤维二糖水解酶（CB），参与淀粉、纤维素和其他α-和β-连接葡聚糖（植物细胞壁的主要成分）的降解；（b）氮循环的酶：β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG），与几丁质和肽聚糖的分解相关联，微生物细胞壁的主要成分和亮氨酸氨基肽酶（LAP），催化肽和蛋白质N端亮氨酸残基的水解；和（c）P循环的酶：酸性磷酸酶（PHOS；磷矿化）。
使用R v3.6.0进行所有统计分析。养分添加对分解参数（k和S）以及酶活性的分析是使用响应比的自然对数和线性混合模型（nlme包中的“lme”函数），N，P和K作为固定变量（全模型包括所有可能的交互作用），嵌套在实验样地内（随机变量）。本研究还使用线性混合模型来探索分解参数、所有单个酶活性和从WorldClim中提取的生物气候驱动因素之间的关系。
用先验的知识建立一个概念模型，随后使用结构方程模型对其进行检验。混合线性模型的结果用来微调选择的变量，例如，通过显示哪些气候变量最能解释微生物酶的活性和分解。在先验模型中，考虑到距离赤道的距离，以解释潜在的空间效应和未观测变量的作用，这些变量可能在大的地理梯度上变化。预测了赤道距离、气候和试验处理对微生物酶活性、植物残体分解和生化转化的影响。本研究在模型中没有考虑营养元素之间的相互作用，但是考虑了营养元素添加量和气候之间的相互作用。分析中的气候驱动因素包括年平均降水量、年平均温度和最湿季的温度。在概念模型中，预测微生物活动会影响k和S。分解速率k被认为是稳定因子S的预测因子。本研究假设到赤道的距离和气候变量，和与在绿茶和红茶上测得的微生物酶是共变的；因此，使用相关误差项对它们进行建模。最后，将与氮矿化有关的微生物酶类包括在内，而不是与C和P有关的其他微生物酶，因为尽管所有的酶都高度多元相关，但与N相关的酶呈现出最清晰的机制。
结果
埋藏的植物残体的初始分解速率（k）在P，NP，NK +μ和NPK +μ添加中分别增加了35%，41%，43%和79%（图1a和2；图S3）。当所有的N或者P处理联合考虑时，埋藏的植物残体的初始分解速率（k）也随着N或者P添加微弱增加。本研究没有发现显著的交互作用，仅仅添加K +μ也没有影响。埋藏的植物残体的稳定因子（S）响应所有的养分添加处理增加了14%到22%，除了仅仅N添加的处理（图1b和2；图S5）。当考虑所有的N或者P处理时，N和P添加也有较高的稳定因子（S），但是K +μ添加中没有。关于原始质量损失数据的结果，用于计算TBI参数，揭示了在响应所有的养分添加处理时绿茶质量丢失了3%到6%，除了仅仅N添加的处理（图1b,c和2）。当所有的N或者P处理综合考虑时，随着P的添加绿茶质量的丢失减少，红茶质量的丢失随着N添加而增加。
图2 养分添加对初始分解速率（k）和植物残体的稳定因子（S），绿茶和红茶质量丢失以及主要的生物地球化学循环（C，N和P）以及基于绿茶（G）和红茶（R）分解的微生物的胞外酶的影响。AG，α-葡萄糖苷酶；AP，酸性磷酸酶；BG，β-葡萄糖苷酶；CB，纤维二糖水解酶；LAP，亮氨酸氨基肽酶；LnRR，响应比（变量处理/变量对照）的自然对数转化；NAG，N-乙酰基-葡糖糖苷酶；XYL，木糖酶。误差棒代表95%的置信区间。误差棒不穿过0线的变量呈现黄色并且表示在p <0.05时的显著性。
在不同的底物类型中，涉及到C，N和P生物地球化学循环的微生物酶活性不同。绿茶残留物，最初主要由大多数不稳定基质组成，相对于红茶的残留物（有较高比例的难分解底物），有更高的C-相关的和P-相关的微生物酶活性速率。而且，基于植物残体的分解养分添加影响潜在的微生物酶活性，尽管对于更难分解的红茶残留物影响更大和更常见（图2和3）。NP和NPK+μ的添加增加了N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性，一种涉及到N矿化的酶，基于红茶的测量，分别增加了42%和45%（图2f,g），然而基于红茶的测量，N或者NK+μ的添加分别增加了20%和28%的磷酸酶活性（图2a,f和3f）。当所有的N处理同时综合考虑时，基于红茶的测量，N添加虽然微弱但是持续增加了C-，N-和P-相关的酶的活性（图3b,d,f）。当所有的P处理同时综合考虑时，在红茶中P添加微弱增加了微生物C-和N-相关的活性，并且降低了P-相关的活性（图3b,d,f）。更深入的探索分析表明磷酸酶活性主要的差异存在于仅仅P添加和NK+μ的处理之间，表明在分解植物上测定的磷酸酶活性的潜在有用性仍然是全球草原微生物分解磷限制的指标。基于绿茶的测量，K+μ的添加减少了β-葡萄糖苷酶活性（图2c）。当所有的处理同时综合考虑时，K+μ的添加减少了绿茶底物中的C-和N-相关的酶的活性。
图3 养分添加对与C，N和P生物地球化学循环相关的微生物酶活性影响的箱型图，基于不同的底物类型的植物残体分解（绿茶[图a，c和e]，红茶[图b，d和f]）。
尽管在本研究中，养分添加增加了埋藏的植物残体的分解和生物化学转化，但是响应不同处理的分解参数和响应值在不同的研究地点间和研究内存在巨大差异（图1,2和4）。例如，基于红茶的测量，分解速率（k）随着微生物酶活性和年平均温度的增加而增加，以及年平均温度的降低而增加（图4a-d）。稳定因子与基于红茶底物测量的微生物磷酸酶活性正相关（图4e）。而且，气候条件调节了养分对分解的影响。例如，年平均温度较低的研究地点，分解速率对N的添加有更积极的正向影响（图4b）。本研究发现，在接受更高的年平均降雨量的研究地点，P添加对分解速率有更积极的正向影响（图4d），然而施肥对稳定因子增加的影响是在年平均温度较高的研究地点（图4f）。
图4 初始分解速率（k）和稳定因子（S）与他们最相关的微生物（a,c,e）以及气候控制因子（b,d,f）之间的关系。
结构方程模型解释了25%的k变异和31%的S变异（图5）。本研究发现，N和P添加对k和S的持续正效应高度依赖于气候变量，通过添加N和P影响N矿化有关的微生物酶活性来实现（基于稳定组分埋藏的植物凋落物的测量）。总而言之，N和P肥添加在更湿润和冷的气候条件下增加了这些响应变量。
图5 结构方程模型。实线=正相关。虚线=负相关。线的宽度代表相关性强度。双向灰色箭头表示具有相关误差项的变量。微生物N胞外酶=基于绿茶和红茶底物分解测量的与N生物地球化学循环相关的微生物酶。指向蓝色圆点的箭头表示重要的交互项。
讨论
本研究的结果证明了在响应土壤养分添加时，初始分解速率（k）的加速和后期生物化学转化的增加可能是普遍现象，依赖于植物残体的来源和化学组成。这些结果与荟萃分析的结果一致，即7.5-12.5 g N m-2 year-1的N添加增加了生态系统中的分解速率，但是与全球潮汐湿地的研究相反，其研究表明N添加对S有负的影响（Mueller et al., 2018）。本研究也首次证明了基于聚合无保护的植物残体的微生物分解受N和P有效性的限制，但是在全球尺度上其它必需的养分（K+μ）也是植物分解的相关驱动因子，并且不能被忽略。而且，本研究的结果表明养分管理改变全球草原植物残体分解的潜力有限，因为这种影响的程度适中，而且在不同地点的差异很大。然而，本研究的结果是不完整的，因为我们的培养时间仅仅90天，这是早期分解轨迹的一个关键指标，但可能不能反映土壤养分富集对草原分解的长期累积效应。
尽管分解对养分添加的响应存在以上这些一般模式，但在不同的研究地点，埋藏植物残体的分解差异很大，这可能是由于当地气候条件的变化和土壤微生物群落处理植物残体的现场级“metabolic toolkit”。例如，本研究在较低温度下有更大的生化转化的结果并且与全球潮汐湿地研究一致（Mueller et al., 2008）。本研究的研究结果也与全球草地最湿季样地温度与实验室净氮矿化量呈负相关关系，但与田间土壤培养时两者之间的正相关关系一致（Risch et al., 2019）。此外，随着降雨量的增加，分解的加剧与使用茶叶袋的全球研究相一致，从而加强了气候作为陆地生态系统早期凋落物分解的主要驱动力的作用。
再加上气候和土壤微生物分解“metabolic toolkit”的作用，养分的添加显著改变了分解参数与气候条件的一些关系，包括降雨和土壤微生物酶。这些结果进一步证明了水和多种必需养分的有效性对分解的广泛共同限制；这些因素对全球草原的植物生产力和土壤C捕获也很重要。这些结果表明，多种养分限制、土壤富营养化和气候因素之间存在着强烈的耦合关系，在未来的施肥制度/养分污染情景以及气候变暖和干旱的情况下，可能对全球C循环产生复杂的影响（Falkowski et al., 2000）。
微生物酶活性在不稳定基质中持续较高，这可能反映出土壤微生物群落有更大的能力快速定殖和分解更多的不稳定基质和更大比例的可水解大分子。而且，在K+μ添加下微生物活性的下调表明这些酶当中的一些酶的释放可能与从不稳定的有机底物中矿化其它必需的大量和微量元素（当它们供不应求时）相关联。这些结果表明在不同的实验处理中以及植物底物中微生物新陈代谢表达的不同，可能是由于土壤细菌和真菌群落组成和丰度的变化。这些结果还表明，由于富营养化，植物群落组成的变化及其死物质输入质量的相关变化可能进一步改变土壤微生物群落的功能。
最后，本研究想在生态系统水平理解全球草地土壤富营养下，理解k和S的气候和微生物的驱动因子，所以本研究使用了结构方程模型。k也与S正相关，表明早期阶段的快速分解与后期缓慢分解、高度生化转化的植物残体的更多的积累相适应。这可能与微生物在快速分解和消耗不稳定植物残体过程中产生的微生物废物更有效地稳定有关。一种可能的解释是，微生物善于快速分解植物残体，被选中的材料是容易分解的，并且战胜了那些分解更复杂C的微生物，从而留下大量未分解的物质，最终在生化上稳定下来。
本研究表明降水和温度是陆地生态系统早期微生物凋落物分解的主要驱动力。本研究也表明在全球的草地生态系统中埋藏的植物残体的微生物分解虽然微弱但是持续受多种必须的大量和微量养分的共同限制并且会对气候变化和土壤富营养化做出交互响应。在管理的草地中限制性养分元素的添加（作为一种可行的策略）可能会增加土壤C循环，进而增加土壤C的扣押（Prescott, 2010）。这些通过没有物理保护的植物残体（与土壤联系紧密并且在转化后最终可能成为难降解的腐殖质化合物）的生物化学转化发生。然而，本研究的结果也表明这些努力的结果可能是微弱的并且受到全球变暖和增加的干旱事件的阻碍。不管怎样，这种气候的依赖性以及众所周知的N沉降和无机肥料添加对地上和地下多样性负的影响表明草原土壤富营养化的环境和经济代价会不成比例的高于任何由于植物残体增加的分解和生物转化的潜在的积极的影响。
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