科研 | Science：肠道菌群介导的胆汁酸代谢通过NKT细胞调控肝癌（推荐阅读）
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肝脏疾病通常与肠道菌群组成的改变或失调有关，而且肠道菌群产物有助于肝细胞恶性转化，还参与癌症的免疫治疗。肠道共生细菌还可以介导初级胆汁酸代谢为次级胆汁酸，后者通过肠肝循环（门静脉）回流到肝脏，参与肝癌的发展。本研究描述了肠道菌群通过介导胆汁酸代谢调控趋化因子依赖性的NKT细胞聚集以及肝内抗肿瘤免疫的机制，提示肠道菌群通过胆汁酸形成的肿瘤免疫可能成为未来的肝癌治疗策略。
导读配图
论文ID
原名：Gut microbiome–mediated bile acid metabolism regulates liver cancer via NKT cells
译名：肠道微生物群介导的胆汁酸代谢通过NKT细胞调控肝癌
期刊：Science
IF：41.058
发表时间：2018年
通信作者：Tim F. Greten
通信作者单位：NIH国家癌症研究所癌症研究中心，胃肠道恶性肿瘤科，胸胃肠道肿瘤科
实验内容
引言
肠道微生物可以调节抗肿瘤免疫，是控制化疗和免疫治疗疗效的关键因子。已有研究发现，肝脏通过门静脉暴露于肠道菌群成分及其代谢物，而且肠道菌群对肝细胞癌（HCC）具有重要影响。
一、不同小鼠模型中肠道微生物群对肝癌的抑制作用
在MYC转基因小鼠诱导的原发性HCC模型中，ABX（由万古霉素、新霉素和普利马辛组成，对肝脏无毒性）处理消除小鼠肠道共生细菌后，HCC数量减少，体积减小（图1A）。
C57BL/6小鼠皮下植入EL4胸腺瘤后，ABX处理没有改变皮下肿瘤的生长，但减少了肿瘤的肝转移（图1B）。
脾内注射B16肿瘤的小鼠模型中，ABX处理显著减少肿瘤肝转移（图1C），而通过尾静脉注射B16肿瘤细胞时，ABX处理却增加了肿瘤肺转移。
使用A20细胞在BALB/c小鼠中的研究发现了类似现象（图1D）。
这表明，调节肠道共生菌可以特异性地改变肝内肿瘤的生长动力学。
图1
二、肝脏NKT细胞聚集先于肿瘤抑制
作者检测了ABX治疗后EL4荷瘤小鼠的免疫细胞亚群，结果发现肝脏自然杀伤T（NKT）细胞和CD8+T细胞的显著增多（图2A）。而其他免疫细胞亚群（B细胞、CD4+T、NK、γ/σT细胞和G-MDSC）未发现变化。
在ABX处理的MYC小鼠HCC模型（图2B）中也观察到肝NKT细胞的聚集，但没有CD8+T细胞聚集，且脾脏NKT细胞保持不变，这提示免疫细胞聚集的肝脏特异性效应。
ABX处理的无瘤C57BL/6或BALB/c小鼠比未经ABX处理的小鼠，肝脏中NK细胞的绝对数量和相对比例均有升高，脾脏中并未观察到类似情况，并且与性别也无关联（图2C、D、E）。
所有肝NKT细胞中均表达趋化因子受体CXCR6，后者可以介导肝NKT细胞的活性和聚集，且肝脏内表达CXCR6的细胞中75%都是NKT细胞，这一比例在ABX处理后也没有变化（图2F、G、H）。
C57BL/6和BALB/c小鼠肝脏中，CXCR6+细胞在ABX处理后升高2倍（图2I）。CXCR6同时也在T细胞中表达，ABX处理后，CXCR6阳性且CD62L低表达CD44高表达的效应记忆性CD4+和CD8+T细胞均有增加。由于大多数NKT细胞是CD62L低表达CD44 高表达的效应记忆性细胞，检测NKT细胞的活化状态发现，无论是荷瘤小鼠（图3B、C）还是无瘤小鼠，几乎所有的肝NKT细胞都是活化的CD69高表达亚型，而CD25和4-1BB这两种活化标志物在ABX处理后的肝NKT细胞中并无变化。这表明，ABX处理的小鼠NKT细胞更加活跃（图2K）。
活化NKT细胞能够通过释放细胞因子发挥多种作用。因此特异性抗原刺激后，ABX处理的小鼠肝NKT细胞中检测到了较高水平的干扰素-γ（IFN-γ），说明其已经启动肿瘤免疫，而肿瘤坏死因子（TNF）表达无变化（图2J）。这表明，清除肠道共生细菌赋予了肝NKT细胞更强的抗肿瘤作用（细胞毒性没有变化）。
图2
肝NKT细胞大部分为NKT1，NKT细胞亚群水平无变化。有趣的是，ABX治疗后，NKT细胞生长所需的PLZF在肝脏表达中显著降低，在脾脏中没有表达。
调节性T细胞（Treg）是肿瘤进展中的重要调节因子，但ABX处理的C57BL/6小鼠肝脏或脾脏中Foxp3+CD4+亚群并无变化。
综上，改变肠道微生物导致肝脏NKT聚集，并影响记忆性CD4+或CD8+细胞。活化NKT细胞在遇到抗原负载的肿瘤细胞时会产生IFN-γ，抑制肿瘤生长。
三、肝NKT细胞介导肿瘤抑制
研究调控肝肿瘤免疫的特定免疫细胞群发现，ABX预处理的C57BL/6小鼠脾内注射B16肿瘤细胞前1天进行T细胞清除（图3A）。清除所有肝内的三大类细胞亚群（CD4+T、CD8+T和CD4+NKT细胞）完全逆转了清除肠道共生细菌（图3B、C、D）对肿瘤肝转移的抑制作用，而单独清除CD8+T细胞仅有轻微作用。
NKT细胞的抗肿瘤作用可以表现为对表达CD1d的肿瘤细胞的直接杀伤，还可以通过特异性抗原呈递细胞的交叉呈递，在不表达CD1d的肿瘤中识别肿瘤抗原。使用CD1d敲除小鼠（完全缺乏NKT细胞）和CXCR6敲除小鼠（仅在肝脏中选择性缺乏NKT）的研究发现，静脉注射EL4肿瘤细胞可以诱导肝NKT细胞缺失小鼠发生肝癌。清除肠道微生物降低了野生型小鼠的EL4肝肿瘤负担，但两种基因敲除小鼠在ABX治疗后肝肿瘤大小没有减少（图3E、F）。B16肿瘤细胞的实验可以观察到类似结果。
这提示，肝脏NKT细胞对肠道微生物引起的肝脏肿瘤生长是必需的。
图3
四、胆汁酸/CXCL16/CXCR6轴控制肝脏NKT聚集
几乎所有的肝脏NKT细胞都表达CXCR6（图2F），ABX处理增加了CXCR6+细胞在肝脏的聚集（图2L），而CXCR6在NKT细胞上的平均荧光强度没有改变。因此，进一步研究CXCR6的唯一配体CXCL16。
ABX处理的小鼠肝脏中发现较高的Cxcl16 mRNA水平，在肺中并未检测到。肝脏中CXCL16主要来源于肝窦内皮细胞（LSECs），而从ABX处理的小鼠中分离LSECs检测Cxcl16 mRNA水平发现其表达几乎增加了2倍（图4B）。与先前报道一致，LSEC的基础Cxcl16 mRNA水平显著高于非LSEC，ABX处理不影响Cxcl16 mRNA的表达。免疫组化染色证实，LSECs 的CXCL 16蛋白表达增加（图4C）。此外，上调CXCL16在肝脏中的表达增加了肝脏NKT水平。这表明，ABX处理导致LSECs产生更多CXCL16，进而导致肝脏NKT细胞聚集。
细胞表面型CXC16已被证实参与了脂质代谢，而肠道共生细菌可以介导肠内胆汁酸代谢，调节胆汁酸组成。因此，尝试寻找胆汁酸和CXCL16之间的可能联系是一个不错的研究方向。
使用胆汁酸螯合剂——消胆胺来减少肝脏中的胆汁酸水平，同时增加了肝NKT和CXCR6+细胞，但CD4+T或CD8+T细胞不变（图4D），肝脏Cxcl16 mRNA表达上调。这一结果提示胆汁酸通过CXCL16调控参与肝NKT细胞聚集。
测定胆汁酸谱分析参与NKT细胞调节的胆汁酸类型发现，对照小鼠肝脏含有最高量的初级胆汁酸牛磺胆酸（TCA），其次是初级胆汁酸牛磺-β-鼠胆酸（T-β-MCA）和次级胆汁酸牛磺-ω-鼠胆酸（T-ω-MCA）（图4E）。ABX处理不影响肝TCA，但显著增加T-β-MCA和β-MCA。由于肠道共生细菌可以将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，所以在ABX处理的小鼠中，次级胆汁酸T-ω-MCA、牛磺脱氧胆酸（TDCA）、ω-MCA、牛磺胆酸（TLCA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）均有减少（图4E）。
为了把这些发现关联起来，在小鼠原代LSECs中研究胆汁酸对CXCL16表达的影响。初级胆汁酸T-β-MCA诱导了Cxcl16 mRNA，而次级胆汁酸ω-MCA降低了Cxcl16 mRNA表达（图4F）。消胆胺处理降低了初级和次级胆汁酸并导致NKT聚集，所以两种胆汁酸对CXCL16可能具有相反调节作用。经过验证，次级胆汁酸破坏了初级胆汁酸诱导的Cxcl16 mRNA上调，甚至使cxcl16 mRNA表达低于处理前的基线水平（图4G）。当小鼠喂食次级胆汁酸ω-MCA时，肝脏NKT聚集减少，而喂食初级胆汁酸CDCA则增强NKT细胞聚集（图4H）。这表明，初级和次级胆汁酸影响肝脏NKT细胞聚集，并在体内具有相反效果。
接着，将胆汁酸喂给小鼠，以研究其对肝脏肿瘤生长的影响。结果提示，次级胆汁酸LCA或ω-MCA逆转了抗生素引起的肝肿瘤生长抑制，而初级胆汁酸CDCA增强了肿瘤抑制（图4I）。增强CXCL16在肝脏中的表达（图4I）或CD4+NKT细胞的清除可以消除次级胆汁酸对肝肿瘤生长的影响（图4I），表明这种作用是NKT细胞介导的。类似地，次级胆汁酸未能影响肝NKT缺陷小鼠（CXCR6-/-）的肝肿瘤发展（图4J），但仍能阻断由抗生素引起的NKT细胞聚集。因此，抗生素清除共生细菌模型中，初级胆汁酸能诱导CXCL16表达，而抑制CXCL16的次级胆汁酸却有所减少，导致了LSECs中CXCL16的上调和肝NKT细胞聚集。
图4
五、梭状芽胞杆菌属对小鼠肝脏NKT聚集的调节
ABX并没有完全消除肠道细菌，为了排除剩余细菌介导NKT聚集的可能性，实验在无菌小鼠中进行了重复。与SPF对照小鼠（图5A）相比，无菌小鼠中的肝NKT更多，在TLR4敲除小鼠中未见变化。类似的，Cxcl16 mRNA水平在无菌小鼠肝脏中较高（图5B）。
接下来，确定导致肝NKT聚集的细菌。因为ABX含有三种抗生素，所以单独进行抗生素处理以缩小靶向细菌范围。单独使用万古霉素可增加肝NKT细胞，而新霉素仅具有边际效应（图5C）。用头孢哌酮喂养的小鼠肝脏NKT细胞明显增加，但未观察到肝脏CD4+或CD8+T细胞的变化。有趣的是，万古霉素和头孢哌酮都以革兰氏阳性菌为靶点，并可增加初级胆汁酸、消耗肠中的次级胆汁酸，这与前述发现一致，即胆汁酸在肝脏中也发生变化，并调节NKT细胞的积累。
7α-脱羟基反应是由肠道细菌次级胆汁酸生产中的重要反应，受革兰氏阳性的梭状芽胞杆菌簇XIV控制。而增加肝NKT细胞的万古霉素能够消除梭状芽胞杆菌，对肝NKT几乎没有影响的新霉素，对梭状芽胞杆菌的影响不大。
为了探讨梭状芽胞杆菌在肝脏NKT细胞聚集中的作用，作者采用了C. scindens，一种常见于小鼠和人中用于7α-脱羟基反应的保守的胆汁酸诱导基因操纵子。用万古霉素喂养小鼠1周诱导肝NKT细胞后停用，给小鼠灌胃C. scindens或溶剂，C. scindens可以成功定植。一天后，通过16S核糖体（rRNA）测序分析粪便细菌（图5D），与对照组相比，持续万古霉素治疗导致梭状芽胞杆菌和拟杆菌减少，但疣状杆菌增加。停用万古霉素后，可以很快观察到杆菌恢复。C. scindens的饲喂可以增加梭状芽胞杆菌种群。在万古霉素停用后第2天至第4天，肝脏NKT水平开始下降（图5E），表明肠道共生细菌的恢复，梭状芽孢杆菌群XIV也出现恢复。C. scindens的定植诱导了肝NKT细胞的快速减少（图5E），但不影响其他免疫细胞。正如所期，C. scindens的定植（非ABX治疗）导致第2天时初级胆汁酸的减少和次级胆汁酸的回升（图6H）。因此，具有胆汁酸转换功能的梭菌，如C.scindens，参与调节肝脏NKT细胞聚集。
接下来研究C.scindens对肝肿瘤生长的影响。在C.scindens定植小鼠中发现的肝肿瘤比在万古霉素或C. innocum-定植小鼠中更多（图5F、G），这表明介导代谢胆汁酸的肠道细菌可以调控肝肿瘤的生长。
六、胆汁酸对人肝脏CXCL16表达的调控
检测胆汁酸对人肝窦内皮细胞中CXCL16 mRNA表达的影响发现，初级胆汁酸CDCA和TCA诱导了SK-HEP1细胞中的CXCL16 mRNA表达（图5H）。在肝癌或胆管癌患者的非肿瘤肝组织中，初级胆汁酸CDCA水平与CXCL16表达相关（图5I），而次级胆汁酸GLCA则相反。初级/次级的比值与CXCL16的表达增加有关，表明胆汁酸对CXCL16表达也存在相反作用。
图5
粘膜相关恒定T（MAIT）细胞在肝脏富集，人类肝淋巴细胞中占了20～50%。有趣的是，CXCR6在MAIT细胞内表达，肠道细菌是否也可以通过CXCL16调控肝脏MAIT细胞值得研究。MAIT细胞识别细菌衍生物，并参与炎症性肝病，如非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。除了抗肿瘤作用外，NKT细胞已被认为是自身免疫应答的重要调节因子。本研究表明肠道共生细菌和胆汁酸可能是控制肝脏自身免疫性疾病的潜在靶点。
综上所述，本研究描述了肠道微生物利用胆汁酸调控小鼠肝脏NKT细胞聚集，介导抗肿瘤免疫的机制。这些发现不仅对未来的癌症治疗研究具有潜在意义，而且提供了肠道微生物群及其代谢物和肝脏免疫应答之间的关联证据。
点 评
本研究使用多种肝癌动物模型发现了改变肠道共生细菌可诱导肝选择性抗肿瘤作用，并观察到肝CXCR6+NKT细胞的选择性增加，后者介导了肝脏中的肿瘤抑制。进一步的研究发现，NKT细胞聚集是由CXCR6的唯一配体CXCL16在肝窦内皮细胞上的表达调控的。初级胆汁酸增加CXCL16表达，次级胆汁酸显示相反的效果。清除介导初级-次级胆汁酸转化的细菌可以诱导肝NKT细胞聚集，减少肝肿瘤生长，而小鼠喂养次级胆汁酸或定植胆汁酸代谢细菌也产生相反效果。人体组织的研究结果与实验研究一致。
文章详细描述了肠道微生物利用胆汁酸调控小鼠肝脏NKT细胞聚集，介导抗肿瘤免疫的机制，为未来肝癌的治疗策略提供新的思路。小编能力有限，如有不足之处，还请指出，大家多多交流。感兴趣的朋友可通过查看原文了解更多。