科研 | Nature子刊: 环境DNA揭示海洋中微生物群落间的季节变化与潜在联系
编译：Hancactus，编辑：小菌菌、江舜尧。
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环境DNA (eDNA)分析可同时检测到多个营养水平和生命域的生物体，并且能够进一步揭示与生态系统变化相关的生物间相互作用。在本文中，作者使用对环境DNA样品进行多位点扩增子测序调查了加利福尼亚蒙特利湾2015-2016年间18个月采集到的海水样本的生物多样性。在科以及更高的分类级别得到了包含从微生物到哺乳动物的663个分类群。据此，研究者推断了群落组成的变化，揭示了不同类群之间假定的相互作用，并确定了这些群落与环境特性之间的相互关系。通过群落网络分析提供了捕食者与被捕食者之间相互关系、营养联系及其生活领域季节性变化的证据。最终该研究认为，基于环境DNA的分析可以提供关于海洋生态系统动态变化的详细信息、揭示生态系统变化的生物指标，同时提出保护随环境变化较为敏感生物的保护策略。
论文ID
原名：Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a marine community
译名：环境DNA揭示海洋中微生物群落间的季节变化与潜在联系
期刊：Nature communications
IF：11.880
发表时间：2020.1
通讯作者：Anni Djurhuus; Collin J. Closek &Kathleen J. Pitz
作者单位：南佛罗里达大学海洋科学学院; 斯坦福大学海洋解决方案中心、土木与环境工程系、华盛顿大学海洋与环境事务学院等
实验设计
研究者在蒙特雷湾(MB)时间序列站位C1站(36.797°N, 121.847°W)，通过Rachel Carson和Western Flyer每隔两月进行样品采样，如图1所示。采样时，取1 L水样过滤到0.22 μm的聚乙二烯二氟化物滤膜上，将过滤水样后的滤膜至于液氮中保存。带回实验室后，对样品中的DNA进行提取，随后对16S rRNA、18S rRNA, COI和12S rRNA基因进行PCR反应，将目的片段进行跑胶条带大小验证、纯化等实验步骤，最后构建四个基因相对应的克隆文库进行分析。
结果
1. 微生物类群群落结构
经质量控制，共检测到108条基因序列，经比对、注释共得到663个类群，这些类群的生活方式包括了腐生、自养、寄生以及和异养等。为保证得到结果的真实性，避免由于扩增偏好性对PCR产物的影响，研究者结合模型为每个类群进行打分过滤掉低质量的类群，同时，为了能够更加准确的了解海洋当中微生物的分布情况将陆生生物予以删除。经过上述两步骤处理，最终得到348个独特的海洋类群存在，其中274个(78%)在科水平上进行聚类分析。为了评价群落丰度随时间的比例变化，研究者对每个分类单元扩增子丰度指数的加权基因相关网络分析(WGCNA)，其中的分类单元(节点)与其他趋势相似的分类单元(边缘)连接在一起。相互连接的亚群落(群落)是从主网络中识别出来的，代表了来自生命和营养水平所有领域的分类单元集合，它们的比例丰度随时间发生了强烈相关的变化。相关的变化可能来自直接或间接的营养相互作用，也可能来自对环境因素的一致反应。研究者最终确定了基于整个数据集网络分析6个亚群落网络，它们分别代表不同类群及其随时间的变化。对亚群落网络分析的结果显示春季和夏季观测到的环境DNA丰度以及类群与秋冬类群明显不同，造成这一现象可能与外界的环境因素相关，冬季的物种丰富度与较低的叶绿素a水平显著相关(r = −0.76, p =0.03)和秋季的物种丰富度则与较高的海面温度显著相关(r = 0.74, p = 0.04)。
图1 环境DNA与环境变量相关的加权基因相关网络分析(WGCNA)。A图表示利用肯达尔相关系数(Kendall’s tau correlation coefficient)对所有分类单元的丰度指数的变化进行聚类的树状图。不同颜色对应不同的亚群落网络。B图表示观察到的每个亚网络中的类群丰富度。
2 不同亚群落类群组成得时空性
在2015年和2016年春季亚群落中，占主导地位的是中心硅藻类群，占据比例分别为30%和41%，同时在2015年春季和冬季群落类群中，壳缝羽纹硅藻的物种丰富度在所有亚群落以及时间中分布均匀、比例丰富度更高。而在夏季、秋季亚群落中则包含了大部分的鞭毛藻类群，占比分别为26%和20.5%。在2015年12月和2016年12月甲藻丰度最高，约占据所有类群总数的35%，研究者认为，这一波动现象符合由厄尔尼诺现象造成的复合季节性上涌，除甲藻外，桡足类丰度在2015年冬季也相对较高，约占当时分类单元总数的38%，进一步研究发现，秋季和冬季群落与环境参数的相关性最强，其中，秋季亚群落中共有81个优势类群，这些类群在海洋表面温度大于14℃时更为常见，冬季优势亚群落则由114个优势类群组成，这些类群的分布与叶绿素a呈负相关。
图2 所选类群随时间变化的网络可视化和振幅指数丰度变化
a-c图表示2015年和2016年秋季亚群落的物种组成以及不同类群之间的相互关系，d-f表示2015年12月(灰色) 亚群落的物种组成以及不同类群之间的相互关系。a图中的蓝色和d图中的灰色表示网络连接(边缘权重)大于0.2阈值的分类单元；b图和e图表示所检测到的不同类群在不同营养级中占据的比例；c图和f图表示不同类群在我们所采集到的样品中不同类群所出现的时间；
3 微生物网络与环境变化的对应关系
秋季和冬季采集样品的群落结构分别与高温和低叶绿素a浓度相关，表现出与环境条件变化相关的生物群落变化情况。在这些群落结构中，微生物类群的丰度指数与相同的协变量之间存在可预测的相关关系。例如，冬季群落结构中的大部分类群与叶绿素a呈负相关，与溶解氧也呈负相关。在秋冬季群落结构中，单个类群与环境变量(温度、叶绿素a)的相关性与这些类群显著相关。最近的研究表明，中心度可用于识别关键分类群，其准确率高达85%，虽然这种预测能力还没有在从微生物到哺乳动物的各种营养水平的研究中得到实证检验，但在相互联系最紧密的类群(前10%)与温度或叶绿素a显著相关的类群中，研究者发现了所有营养水平和所有生命领域的代表，在秋季的群落结构中，不同营养类群的代表包括刺螠科(多毛纲)、原生生物和浮霉菌(细菌)，这些类群分别代表二级消费者、初级消费者和腐生动物，在冬季群落结构中，前10%连接类群的代表是多囊藻属 (放射虫科)、钩吻鱼科(钩吻鱼科)和海藻类(古藻类)，这些则分别代表初级消费者、次级消费者和混合营养体。
图3 类群与环境变量的偏最小二乘法分析，以及类群与环境的关联度和相关关系图。a图表示偏最小二乘分析图显示的分类单元(列)与环境因子之间的相关性聚类分析图。热图颜色深浅代表相关系数的大小，星号表示在b图和c图中红色水平线之上、每个群落结构中连接最多的前10%的类群。b图表示在秋季采集到的样品与温度之间的相关性，c图表示在冬季采集到的样品与叶绿素a含量之间的相关性，不同形状的符号分别对应于图例中显示的不同营养水平。
讨论
由于单个类群对环境条件变化的反应不同，因此对复杂生物群落间的时间变异性予以评估是一项艰巨的任务。经研究结果证实，海洋生物群体可以有效地聚集成群落(子网)，这些群落的组成和丰度随时间而波动。对某一地点的生物多样性进行全面的分析可以帮助确定以前不为人知的类群，这些类群可以作为由于外部环境或生物因素(例如：温度、pH值、营养有效性或食物网络相互作用)所产生的关键物种。将环境DNA标记技术应用于更长时间序列的生物多样性监测可以进一步增强该技术预测生态系统对气候变化响应的能力和有效性，并有助于制定合理的保护战略。
在本研究中发现，使用环境DNA标记技术不仅可以帮助识别更多的分类单元，也可以检测到一些难识别的类群。DNA的扩增很容易受到引物偏好性的影响，也很难避免抑制剂、模板DNA丰度变化等对最终扩增结果的影响，这些因素会对最终检测到的类群产生很大的影响。然而，对环境中的DNA样品进行分析则可以在很大程度上减小这些因素对最终结果的影响。同时，对环境中DNA样品进行整体的分析跨越了许多营养层次和不同的领域，这使研究者能够深入发掘亟须保护的目标物种，将这些目标物种与传统方法(例如，丰度测量)等相结合，可以更加深入调查特定的生物体或目的群落。
我们举例来说明环境DNA标记技术的作用，首先要对不同微生物之间的营养级进行分析，例如特定初级生产者和微生物群的共存；接着建立假设，将这种相互关系扩展到有充分记录的捕食者和猎物之间的相互作用(例如，须鲸和磷虾)。在灰色网络中，海狮科、蟹科和桡足类的共生关系被认为是捕食者与被捕食者之间的关系，太平洋鲭鱼是加州海狮食物链中一个特别重要的组成部分，它们的共同出现究竟是由捕食者和猎物之间的关系直接驱动，还是对外部因素共同驱动目前仍不清楚。同时，在这个网络中有几个分类单元同时出现，包括小杆菌科(细菌)、红螺杆菌科(细菌)和两个寄生类群，原生生物和鞭毛藻，这个网络支持捕食者和猎物同时出现的假说，因为原生生物和鞭毛虫是已知的桡足类、放射虫、甲壳类和一些鱼类的寄生虫。此外，不同子网中的分类单元也可能存在相互作用。
结论
鉴于全球气候变化和海洋空间、资源的日益利用，对生物多样性的深入了解成为界定保育优先次序的基础条件。大多数海洋时间序列研究的重点是确定有限的一组生物(如：细菌、浮游植物、浮游动物、鱼类、哺乳动物等)变化，这些变化往往与环境条件有关，然而目前的大多数研究却很少探讨它们之间的生物相互作用，缺乏量化生物多样性所需的实用方法和专业知识，这在一定程度上阻碍了全面的生态系统研究。环境DNA标记方法的发展为海洋生物多样性提供了一个独特的视角，它使我们能够同时观测到多个营养水平和生命领域的生物，从而提供与生态系统变化相关的、生物间相互作用的关键信息。在本文中，研究者对四种基因进行了扩增子测序，进行了精细的数据质控（包括使用模型进行打分、移去可能出现于陆地生的生物），在分析时，也使用到了加权基因相关网络分析(WGCNA)的方法，将质控后的类群分成6个不同的亚群落，分别分析这些群落与环境因子之间的相关性。同时，在对生物类群进行分析时，结合考虑了不同微生物所对应的营养方式、在食物网中的分类地位，研究者最终期望得到的结果是希望通过对环境DNA进行分析，从而可以揭示生物系统中关键的生物指标，同时通过对这些生物指标的观测对跨越不同时间尺度和地点的环境变化引起生物多样性变化的预测。
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