【LorMe周刊】特洛伊木马的产生：铁载体pyoverdine吸收策略的改变
作者：樊哲，南京农业大学硕士在读。主要研究铁载体介导的微生物互作。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊介绍铜绿假单胞菌中铁载体次要受体的缺失产生更适合种群入侵菌株。原文2020年发表于《The ISME Journal》上。
由于抗生素的滥用，抗生素抗性细菌病原体的出现成为医疗保健中的关键问题，基于公共物品的微生物社会互作的作弊手段成为了新的潜在治疗方法，但以往通过改变公共物品生产功能产生的作弊菌株常常因为环境结构化而入侵失败。因此，本文通过调控公共物品-铁载体pyoverdine的吸收策略而不是其生产功能，寻找适用于菌群入侵的“特洛伊木马”菌株。作者通过删除或过表达病原铜绿假单胞菌MPAO1摄取pyoverdine的主要受体（FpvA）和次要受体（FpvB），研究菌株吸收策略不同对其生长及竞争能力的影响。结果发现在抗生素的胁迫下，无论是在结构化环境还是非结构化环境中次要受体突变体都可以成功地入侵铜绿假单胞菌种群。说明通过改变菌株吸收公共物品的策略可以更好的入侵野生菌群。
在限铁条件下培养铜绿假单胞菌MPAO1、主要受体突变体（ΔfpvA）、次要受体突变体（ΔfpvB），以及不产生pyoverdine的突变体（ΔpvdA）。结果表明，无论是主要受体还是次要受体的缺失都不会影响菌株的最大生长速率，但ΔfpvA相较于野生型MPAO1和ΔfpvB显示出更长的延迟期。当补充能减轻生产负担的外源性pyoverdine时，所有菌株的生长速率都有所提升，而ΔfpvA相对于其他菌株的生长速率明显降低并且滞后期延长（图1A，B）。ΔfpvA单位细胞pyoverdine产量较低，但在达到最大生长速率之前pyoverdine积累量较大（图1C，D），这表明主要受体FpvA在有效吸收和协调pyoverdine合成中起着重要作用，对于pyoverdine的最佳摄取是必不可少的，而次要受体FpvB只能部分补偿FpvA的缺乏。
作者在所有菌株中插入抗性基因，研究在庆大霉素存在的胁迫环境中pyoverdine的合成和接收动力学，探究胁迫环境下生产pyoverdine的成本变化（图2）。结果显示，在铁受限的条件下，尽管菌株对庆大霉素具有抗性，但它的存在会延长菌株生长的滞后期（图2A）并降低菌株的生长速率（图2B）。在限铁条件下，MPAO1、ΔfpvA、ΔfpvB菌株单位细胞的pyoverdine生产量不同，但在补充pyoverdine后，菌株间没有显著差异（图2C）。在铁的限制下，ΔfpvB首先开始生产pyoverdine，并且在达到最大生长速率之前pyoverdine积累量最小——投资成本最低（图2D）所以ΔfpvB具有最高的收益成本比。这些结果表明，ΔfpvB在抗生素胁迫下表现最佳，说明pyoverdine次要受体的进化需要付出昂贵的代价。
作者使用转录融合监测两个pyoverdine受体的表达动态。在没有庆大霉素的情况下，与ΔfpvB菌株相比，MPAO1较早地触发了主要受体FpvA的表达，并且FpvA表达量更高。添加庆大霉素后，FpvA受体的表达在MPAO1和ΔfpvB菌株中总体增加，但ΔfpvB转录FpvA的时间要早于MPAO1（图3A）。除菌株ΔfpvA外，所有菌株的次要受体FpvB的转录水平均较低，这可能是因为菌株要通过增加次要受体的表达来补偿主要受体表达的缺乏（图3B）。这些结果表明，ΔfpvB的主要受体FpvA的表达相较于MPAO1显著降低，但是在庆大霉素的存在下ΔfpvB会更早开始表达。这种表达模式的改变可能会提高ΔfpvB突变体的适应性优势。
接下来测试了过表达次要受体FpvB对MPAO1菌株以及ΔfpvA菌株生长的影响。在存在庆大霉素且铁受限的情况下，FpvB的过表达有利于ΔfpvA的生长，但MPAO1中FpvB的过表达具有相反的作用（图4A，B）。结果说明，在庆大霉素胁迫下，由于FpvA受体存在，FpvB的过表达会降低菌株的适应性。而在ΔfpvA菌株中FpvB过表达则会使其达到最大生长率前所需的pyoverdine成本减少，但在MPAO1中情况相反（图4C，D）。
接下来，将野生型和突变株以0.85：0.15的比例混合研究菌株的竞争情况。在没有庆大霉素的情况下，突变体均无法入侵MPAO1种群（图5）。而在庆大霉素的存在下，ΔfpvB和ΔpvdA突变体具有巨大的适应性优势，使MPAO1濒临灭绝（图5）。表明pyoverdine在压力条件下的生产成本较高，使得作弊行为有利可图。ΔfpvB突变体的成功入侵说明了由于次要受体的表达成本较高，所以在抗生素胁迫下，次要受体缺失可使突变体从较低的起始频率入侵野生型种群。
为了测试ΔfpvB突变体是否可以在结构化环境中入侵MPAO1种群，将MPAO1和不同突变体的混合物接种到多通道室中进行重复竞争实验。结果发现存在庆大霉素时，在生物膜的环境中与液体环境中一样，ΔpvdA和ΔfpvB都占据了主导地位（图6A）。
最后，将Galleria mellonella幼虫作为模型探究在宿主的结构化环境中，野生型菌株与不同突变株共同侵染的结果。结果表明在动物模型中ΔfpvB也可成功入侵野生型种群（图6B）。
该研究通过调节pyoverdine受体改变菌株pyoverdine吸收策略从而获得了能够成功入侵铜绿假单胞种群的“特洛伊木马”菌株。在抗生素胁迫下，次要受体缺失的菌株（ΔfpvB）具有更高的成本收益比且能够更早的表达FpvA，提高了其在该环境下的适应性优势。并且无论是在结构化还是非结构化环境（包括动物模型）中，ΔfpvB都能成功入侵野生型菌群（MPAO1）。说明次要受体突变体菌株可以作为成功入侵野生菌群的“特洛伊木马”菌株。
论文信息
原名：Loss of a pyoverdine secondary receptor in Pseudomonas aeruginosa results in a fitter strain suitable for populationinvasion
译名：铜绿假单胞菌中铁载体次要受体的缺失产生更适合种群入侵菌株
期刊：The ISME Journal
IF2020：9.4930
发表时间：2020.12
通讯作者：José I. Jiménez
通讯作者单位：英国萨里大学健康与医学学院