细胞株稳定性研究方法

1.从细胞复苏（2×108个细胞）到生产（20m3）细胞至少需要分裂16次；

2.稳定性试验至少测试细胞分裂40次；

3.用于疫苗生产用的正常的二倍体细胞通常在一定的分裂次数内保持稳定；

4.连续培养的细胞系的核型不断变化。

体外培养的细胞发生基因突变和表观遗传学改变的几率很高。这有可能是受培养条件的影响。比如，一些类型的干细胞在细胞密度、氧气浓度和生长因子浓度等条件发生改变时会发生分化。用于疫苗生产的细胞多数是二倍体，在既定的培养条件下相对稳定。在生产上能接受的倍增次数范围内，这类细胞不会出现可见的表型或染色体上的变化，因此生物生产工艺上对这类细胞的稳定性关注较少。

细胞株稳定性涉及：

1.生产能力随时间下降；

2.产品质量随时间变化；

3.核型随时间改变；

4.染色体畸形；

5.后面两项对蛋白类生物制品可能影响不大，但是细胞治疗中需要考虑的。

相反，通过转染、扩增、筛选获得的生产重组蛋白的高产细胞株可能更不稳定。首先用于高产细胞株构建的非整倍体宿主细胞本身的稳定性就低于二倍体细胞。非整倍体宿主细胞除了染色体数目异常外，还存在染色体结构畸形。这就导致了即使同一宿主细胞来源的不同细胞株具有不同的核型。核型差异和染色体畸形是高产细胞株的遗传特性。即使生产用细胞株在稳定性上可能不及二倍体细胞，但是他们必须具备在一定的倍增次数内保持其生产特性、生长状况、蛋白质量的相对稳定。

假设进行10,000批10,000L规模，最终细胞密度为10E10 cells/L的生产，选定的细胞株需要进行接近80次的倍增。次数远远超过从一个受精卵发育成一只仓鼠、老鼠甚至是成人所需要的倍增次数。在如此长的周期内，某些细胞内基因突变、表观遗传学改变或者染色体重排不可避免，而这是目前无法解决的。

为测试细胞的稳定性，需要对细胞40-60次倍增范围内进行生产能力以及基因拷贝数的检测。从液氮罐中10e10个细胞复苏到生产规模反应器生产，细胞需要进行15次倍增，所以40次倍增稳定测试就足以提供充分的数据。（如果起始细胞为10e7开始复苏，到10,000L反应器需要多少次倍增呢？）

产品质量稳定性更难评估，基因突变，比如糖基转移酶突变，可能会会影响产品质量。一个或多个拷贝中碱基突变会影响到蛋白氨基酸序列。由于基因组中外源基因不同拷贝的转录和翻译效率不同，不同的突变引起的对产品质量的影响不尽相同。通过高通量基因测序技术，可以检查出细胞群体中甚至很小水平的突变。