国自然热点大碰撞——当癌症中的外泌体邂逅miRNA时
从上世纪八十年代首次在体外培养绵羊红细胞的上清液中发现能被多种细胞分泌的囊泡起，近年来外泌体的热度可谓有增无减。而当2006年瑞典卡罗林斯卡医学院将诺贝尔生理学或医学奖授予安德鲁·菲尔（Andrew Z．Fire）和克雷格·梅洛（Craig C．Mello），以表彰他们在“RNA基因沉默”方面的发现时，非编码RNA便宣告登上科研界镁光灯的舞台，开启属于他们十数载的叱咤风云。那么在特定的癌症中，当外泌体邂逅miRNA三大热点汇聚碰撞时，会产生怎样的火花呢？今天万事君从文献里解读。
乳腺癌作为女性的一种恶性肿瘤，其成纤维细胞（CAFs）可以通过调节细胞外基质的重塑和生长因子信号传导来调节肿瘤的转移。而外泌体是由细胞主动向胞外或体液中释放的纳米级双层囊泡小体（直径在50-150nm），是相邻细胞间的一种交流通讯形式，其携带多种遗传物质，特别是携带的miRNA是公认的癌症治疗靶标和检测生物标志物，其中miR-181d-5p与乳腺癌的形成和转移有关，然而在乳腺癌中的详细作用尚未不明确。
首先作者利用生物信息学数据库，从基因表达综合数据库GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中检索与乳腺癌相关的基因表达数据集，用于差异分析，分析miR-181家族中miR-181d-5p对应芯片GSE61304中相关靶基因的p值，选择p值最低的基因作为乳腺癌EMT的关键基因——发现HOXA5在乳腺癌中极显著低表达，同时体外的qRT-PCR定量以及免疫组化实验也得到一致的结论。当然，常见的差异分析还可以使用乳腺癌组织和细胞进行测序分析找差异基因，不过省时费钱。
既然找到miR-181d-5p对应的HOXA5基因，那么HOXA5基因是否会影响乳腺癌的表型呢？诸如迁移、侵袭等行为。于是作者通过过表达或敲减HOXA5，结果显示过表达HOXA5能降低MCF-7细胞的迁移、侵袭和增殖能力，促进乳腺癌细胞的凋亡，同时能抑制上皮间质转化过程，而敲减HOXA5基因则情况相反。说明HOXA5基因的低表达能够促进乳腺癌的发生发展。
既然HOXA5基因与乳腺癌的迁移、侵袭联系紧密，那在基因水平是如何作用的呢？于是作者基于JASPAR预测了可能与HOXA5结合的转录因子，发现CDX2能够与HOXA5启动子区结合。接着又通过ChIP实验验证这一结论，同时Western Blot和qRT-PCR均显示CDX2在乳腺癌中低表达。同时研究发现过表达CDX2，HOXA5表达上调，反之则下降。上述种种结果表明HOXA5的表达受转录因子CDX2调控。
在国自然项目中，如果发现HOXA5的表达受转录因子CDX2调控，那么就可以进行假设设计。接下便是具体的实验验证，为了进一步研究CDX2在乳腺癌细胞中的调控方式，作者对乳腺癌相关的miRNA数据集GSE59247进行差异分析，通过筛选出上下调的miRNA，发现只有miR-181d-5p可以与转录因子CDX2靶向结合，miR-181d-p与CDX2之间可以靶向调控。同时qRT-PCR实验显示miR-181d-p在乳腺癌中高表达。
至此，文章已经形成比较完整的闭环，但好像没有外泌体什么事，其实好戏才刚开始。那么既然发现miR-181d-5p与CDX2的关系，也发现在乳腺癌中高表达，那么需要进一步研究miR-181d-5p的功能。
于是作者通过靶向核糖核酸的荧光原位杂交和免疫荧光等技术，用于测定乳腺癌细胞(泛细胞角蛋白[CK]阳性)和肿瘤间质(平滑肌肌动蛋白[SMA]阳性)中miR-181d-5p的表达。发现miR-181d-5p在乳腺癌细胞和肿瘤间质中均高表达。紧接着从乳腺癌组织和邻近的正常组织中分离成纤维细胞（CAFs）和正常成纤维细胞(NFs)，以检测成纤维细胞生物标志物的表达，发现miR-181d-5p在CAFs中的表达高于在NF中的表达。于是作者利用CAFs或 NFs的培养基培养MCF-7细胞，结果发现两者中仅 CAFs能促进乳腺癌细胞的增殖。同时对外泌体miRNA数据库的检索发现，CAFs分泌的外泌体含有miR-181d-5p。因此，作者大胆进行推断，携带miR-181d-5p的CAFs外泌体可以促进乳腺癌的发生发展。
于是作者进行一系列实验进行证明，最终结果表明携带miR-181d-5p的CAFs 外泌体的确能促进乳腺癌细胞的增殖同时抑制细胞凋亡。
至此，文章已经在实验基础上形成比较完整的闭环，从数据库挖掘到细胞水平验证，那么要想进一步增强说服力，还需要在动物水平上得出一致的结论。于是作者注射MCF-7细胞建立异种移植乳腺癌动物模型，通过注射CAFs外泌体，结果发现miR-181d-5p过表达的 CAFs外泌体能够在体内促进乳腺癌生长，抑制细胞凋亡，同时导致转录因子CDX2和关键基因HOXA5表达下调，而敲减miR-181d-5p则出现结果相反。这些体内实验表明含有miR-181d-5p的外秘体通过抑制CDX2和HOXA5的表达，从而促进乳腺癌的生长。
整篇文章在乳腺癌这一国自然肿瘤热点疾病的基础上，将生信数据挖掘——
miRNA与另一大热点——外泌体结合，三大热点碰撞一起浑然天成的感觉，可谓思路巧妙，从生信数据库为源头，最后又落到分子机制上，辅助体内外实验来实现表型和分子机制的完整闭环。最后附一张整体思路图——含有miR-181d-5p的CAFs细胞分泌的外泌体通过调节CDX2和HOXA5促进乳腺癌的EMT，促进乳腺癌细胞增殖同时抑制细胞凋亡。