平台小知识vol.3:测序平台

20世纪最伟大的三大科学计划之一是人类基因组计划,对于基因组,对于遗传这个概念的研究,如人类发展历史一般,都经历过艰辛的探索历程。测序技术的不断发展,使它成为最直接的解读基因密码的解码神器,今天小编就直播一次神器开箱,看看他们的“使用说明”。

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一代测序闪亮登场

中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。并且,在某些病毒中的RNA的自我复制和在某些病毒中以RNA为模板逆转录成DNA的过程是对中心法则的补充。

由此看出,DNA序列可以作为一切的出发点,对揭秘遗传物质,了解生物密码至关重要,对DNA序列的测定的渴望成为推动测序技术发展的原动力。中心法则提出后的二十年,英国化学家桑格(Frederick Sanger)发明了双脱氧链终止法,这个技术加上吉尔伯特(W.Gilbert)发明的化学降解法被称为一代测序技术,因为核心技术为双脱氧终止法,因此一代测序技术也可称为Sanger测序技术。

*Sanger测序介绍简图

Sanger测序原理较易懂:正常的DNA碱基是四种脱氧核糖核苷酸(dNTP),将碱基稍加改造,去除-OH的氧,变成-CH2,就形成了一个双脱氧的核糖核苷酸(ddNTP)。在DNA合成的过程中加上这个ddNTP,由于ddNTP无法和下一个碱基链接,DNA链将终止延伸,PCR反应过程同时加入dNTP与ddNTP,从而产生长短不一的合成产物。将这些长短不同的片段通过电泳加以区分鉴定,解密出序列信息。

*双脱氧终止法

第一代测序技术的特点是测序读长最高可达1000bp,准确性高达99.999%,由于其高精度,现今一代测序仍然是基因检测的金标准,也是对新一代测序结果进行评估验证的主要手段。

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二代测序华丽变革

第二代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)是对传统Sanger法测序的一次革命性改变,是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量测序技术,同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deep sequencing)。

第二代测序技术主要包括:Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。454已经退出历史舞台,简要看一下Solexa和SOLiD技术:

illumina Solexa

illumina的Solexa技术是单分子阵列测序,采用桥式PCR扩增,是目前最受欢迎的技术。其专利核心技术为“DNA簇”和“可逆终止子(reversible terminator)”。Solexa技术的特别在于速度快,几乎是其他测序技术的100倍。

ABI Solid

Solid技术和之前的合成测序略有不同,是一种连接测序技术。不是单个碱基识别荧光,而是连续的双碱基共同编码。超高的通量是其一大特色,SOLiD 3系统单次运行可产生50GB的数据,相当于17倍人类基因组覆盖度。准确性、系统可靠性和可扩展性都很好,缺点是读长太短(25-35bp),运行时间过长。

*二代测序不同平台的相似与差异

现在大家都乐于谈论三代测序,但三代毕竟还没有成为医学检测行业常用的测序工具,那就聊聊二代Plus吧。

Life Technologies Ion Torrent

Ion Torrent使用半导体芯片,在芯片的微孔中固定DNA链。依次加入AGCT的碱基,DNA合成时如果碱基可以结合到模板链则会释放一个氢离子,这个氢离子导致局部PH值发生变化。离子传感器检测到PH 变化后,便将化学信号转变为序列信息。而如果DNA 链有两个连续的相同碱基,则记录到的信号翻倍,从而将其识别。如果不匹配,则记录不到变化。

为什么要叫二代PLUS呢,因为这种技术不涉及荧光激发和拍照,运行时间被大大缩减(仅数小时),无需激光光源,光学系统和照相系统,也不需要荧光标记,规避了这些环节带来的误差。

*Ion Torrent直接检测氢离子,无需荧光检测

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测序技术的医学应用

距离人类基因组计划完成已经十多年,测序技术也走入更长的读长、更高的精准度、更低的成本的发展洪流中,基因产业随之进入疾病基因组研究和分子诊断的应用时代,基因检测技术也是最有望改善全球健康状况的十大关键生物技术之首。测序技术通过检测DNA、RNA的碱基序列信息,准确获得基因突变、拷贝数变异、甲基化修饰、表达量改变、基因融合等信息,应用于肿瘤个体化治疗基因检测、疾病风险预估及个体化健康管理、产前&新生儿单基因遗传病筛查等检测项目。

*肿瘤不同阶段的基因组学解决方案

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衡道优势

上海衡道医学病理诊断中心 基于ABI 3500与Ion Torrent测序平台,提供一系列诊断方案,涉及非小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌等十余种常见肿瘤的分子诊断和个体化用药指导检测项目,满足临床多种需求,提供优质的医疗健康服务。

 参考资料

[1].https://www.wikipedia.org/
[2].https://www.illumina.com/
[3].https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/ion-torrent.html
[4].https://www.abmgood.com/marketing/knowledge_base/next_generation_sequencing_introduction.php

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