PCR聚合酶介绍

PCR方法的问世，使得原本烦杂的操作现在变得非常简便，效率大大地提高了。但另一方面，用于PCR的耐热性聚合酶的种类呈多样化趋势，乍一看会觉得很复杂。由于各种耐热性聚合酶的特性不同，为保证实验的顺利进行，选择合适的酶就显得尤其重要。而这些对于初学者而言却很难。了解各种聚合酶的性质是正确地识别并区分各种酶的特性的前提条件。

用于PCR的聚合酶大致可分为两种：

现在用于PCR的酶主要为来源于高度嗜热菌（主要为Thermus属）或超高度嗜热菌（主要为Thermococcus属、Pyrococcus属等的Euryarchaeota）的耐热性聚合酶。前者如Taq、Tth DNA聚合酶，后者如KOD、Pfu DNA聚合酶等。虽然从同源性来看，聚合酶至少分为六个Family。但一般把从高度嗜热菌中分离出来的聚合酶与大肠杆菌的PolymeraseⅠ分为同一族（A Family），把从archaea中分离出来的聚合酶与真核生物的Polymerase α、δ、ε等分为同一族（B Family）。分别被称为PolⅠ型和α 型。被分在同一族的聚合酶从系统树分析来看，的确靠得很近，但酶的性质和作用却各有不同。虽说如此，在耐热性聚合酶中，被分为同一Family的酶大致上仍显示出很相似的性质，这也是选择酶时的指标之一。

聚合酶保真性的关键：3’→5’核酸外切酶活性：

在很大程度上左右DNA聚合酶性质的活性是『3’→5’核酸外切酶活性』，也被称为校正活性，它决定了PCR的保真性。来源于archaea的B Family酶（KOD、Pfu DNA聚合酶等）具有很强的校正活性。而来源于高度嗜热菌的A Family酶（Taq、Tth DNA聚合酶等）在校正活性方面有所欠缺。因此，在对PCR的保真性有较高要求的情况下，要使用属于B Family的酶。但与不具有校正活性的酶相比，具有校正活性的酶的PCR效率又比较差。最近出现的酶，经过改良，已克服了以上两种酶的缺点，可用以进行高效率且高保真性的PCR。以本公司的产品为例，『G5 DNA Polymerase』就是兼具上述两种特性的酶的代表。为防止该类酶在常温状态下由于聚合酶活性与校正活性而发生预期之外的反应，混合了能中和各活性的抗体。这些抗体会在PCR的变性阶段发生失活，不会抑制PCR反应。另外，市面上还有各种缺失了校正活性（exo-）的B Family酶销售，这种酶虽来源于B Family酶，但保真性却不够好，请务必注意。

TdT活性不能与校正活性共存：

Taq、Tth等A Family的PCR酶，拥有Terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）活性。该活性是在已扩增DNA的3’末端加一个腺嘌呤等碱基的活性。利用该性质进行的克隆方法就是所谓的TA克隆。另一方面，上述的B Family的PCR酶，即便利用TdT活性加上了碱基，结果还是会被强校正活性切除。因此，用该PCR酶扩增DNA的末端就是平滑末端（Blunt end），当然也就无法直接用于TA克隆。相反，用Taq、Tth DNA聚合酶等扩增的DNA片段进行平滑末端连接的效率会显著降低，请务必注意。