【新手福利】外泌体领域新手常见问题（一）
hzangs今天拖更了哦。但是hzangs会在周末奉上本周的周总结的。
经常被一些同学问各种各样的问题！于是在过去的一段时间，闲暇之余整理了一些大家问的比较多的问题，在这里不定期的推出来，给大家作为参考。今天推送第一部分。总共5个问答。 如果对你有帮助的话，就请转发分享给更多需要的朋友吧。
能不能用无血清培液养，能不能用正常培液养到70%换无外泌体血清的培液？
有些paper确实会使用无血清培养液培养细胞然后收上清分离外泌体，论坛中也有已经发表文章的朋友使用该方法，该方法是使用含有外泌体的血清培养细胞到一定密度，然后吸去培液，PBS洗数次之后换无血清培液进行培养即可。但是目前很多高档次的paper基本都是使用含无外泌体血清的培液进行细胞培养的，无外泌体血清可以按照之前hzangs的推文介绍的方法制备。 如果你的无外泌体血清比较珍贵，也可以考虑先将细胞使用有外泌体血清培养，细胞长到一个合适的密度如70%-80%左右时，吸去培液，37℃预热的PBS清洗细胞3-5遍，换无外泌体血清的培液即可。
那种分离方法好？
使用何种方法进行外泌体的分离是一个比较复杂的问题。这个问题涉及到你计划的下游实验是什么。通常来说下游实验涉及RNA的，对外泌体纯度要求可能不高，但是如果下游研究设计蛋白，那么对外泌体的纯度要求还是比较高的。在此列出常见分离方法的一些优缺点供大家根据自己的实验进行选择。超速离心法：操作繁琐，技术难度高，耗时长，分离外泌体纯度较高，目前分离外泌体的金标准；聚合物沉淀法：操作简便，技术难度低，耗时短，分离外泌体纯度低，可能被reviewer质疑；膜亲和法：操作简便，适用于RNA实验，耗时短，技术难度低，分离外泌体的纯度尚可接受；凝胶排阻法：操作相对简单，技术难度略高，分离外泌体纯度高，但很难保证无菌；抗体亲和沉淀法：操作简单，纯度尚可，但是抗体很贵并且抗体不可回收利用。
用哪个marker做WB好？
最常用的是CD63、CD81等等，具体可以参考2016年thery发表的综述文章，在文末有专门介绍囊泡各个marker的使用。论文再这里可以下载到：http://www.exosome.com.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=838&extra=page%3D1&_dsign=26ffa22b
外泌体蛋白做WB用什么内参基因？
外泌体做WB的内参基因一直存在争议。但是按照David Lyden曾发表于CNS的paper，actin和GAPDH 都可以的。
用多少培液收外泌体？
培液使用量取决于细胞系。有些细胞系外泌体释放量高，几毫升即可；有些释放量低，需要上百毫升。一般来说一个普通的细胞系，用超离分离外泌体，第一次摸索条件，起始培液量最好50ml以上。
第一部分就到这里，以后不定期推送相关问答内容。敬请留意。
