【进阶篇】高效液相色谱法的原理、构造、故障

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高效液相色谱法(HPLC)
是60年代末以经典液相色谱法为基础,
引入了气相色谱的理论与实验方法,
流动相用高压泵输送,
采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法 。
与气相色谱法相比具有:
适用范围广,
样品预处理简单,
分离效率高,
流动相选择范围广,
检测方法多为非破坏性的,
流出组分可回收等优点。
正相色谱(normal phase):

流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:氨基柱、氰基柱、硅胶柱。

常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱(reversed phase):

流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有:ODS( C18), C8, C2。

常用流动相为甲醇-水,乙腈-水。
离子抑制色谱(ion suppression chromatography)——调节流动相的pH值,抑制组分的解离,增加组分在固定相中的溶解度,改善峰形,以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。
离子对色谱(ion pair chromatography)——将反离子加入流动相中,与呈解离状态的被测物作用,生成脂溶性的中性离子对络合物,从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度,改善分离效果,达到分离目的。
常用反离子有:季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类

离子色谱法( ion chromatography )

离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术,利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离,用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱,可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。

空间排斥色谱(steric exclusion )

也称凝胶色谱,依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离,类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内,分子越大,保留时间越短。

凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相

对于相同化学组成的高分子化合物,其分子尺寸大小与分子量成正比,因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。

胶束色谱(micellar chromatography)

表面活性剂在水中超过某一浓度(临界浓度)时,多余的表面活性剂不再溶解,聚集而成胶束(胶粒)。

以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系,不是真溶液;流动相中不含有机溶剂。

因胶束色谱法的流动相是多相分散体系,在整个色谱体系中又增加了一相,故也被称为假相色谱(pseudo phase chromatography)。

手性色谱(chiral chromatography)

用于分离手性药物对映体的一种有效技术,可分为直接法和间接法两类:

直接法:

手性固定相法(chiral stationary phase;CSP)

手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)

间接法:

手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)

日常维护和常见色谱故障
溶剂及样品的准备

过滤溶剂的目的湿防止固体颗粒损伤仪器或柱头;未经过滤的溶剂或者溶剂瓶中生长微生物,都会降低溶剂入口过滤头的寿命,并影响泵的性能,一般要求两天过滤一次。

注意:过滤水相或有机相应该选用不同的滤膜

--聚四氟乙烯几乎可以过滤所有的溶剂、酸和碱
--尼龙66可以和大多数的有机物、水相容,

但是建议不要用于强酸、二氯甲烷和DMF

--纤维素滤膜用于水相
溶剂脱气的方法
--氦气脱气
--真空脱气
--回流加热脱气
--超身脱气(最为常用)
避免使用的溶剂
--卤化物碱金属溶液及相应的酸溶液
--高浓度的无机酸如硝酸、硫酸
--能形成自由基的试剂及其混合物
--四氯化碳和异丙醇或THF混合液
--含强络合剂的溶液
 
色谱柱的平衡
为了确保分析结果的再现性,对于反相柱应使用5~10倍柱体积的流动相平衡色谱柱。注意:新装到系统的色谱柱需要进行初始化。先断开柱子和检测器间的管路,用流动相将色谱柱中的原有流动相或气泡移出色谱柱,然后再将色谱柱和检测器间的管路接好。
保护色谱柱
过滤所有的溶剂和样品
使用保护柱
仪器使用完毕,要冲洗整个系统,移走系统中缓冲液
柱子不使用时,两端密封
注意柱子使用的pH范围
不要高压冲洗柱子,不要高温下过长时间的使用硅胶键合相
常见色谱故障-基线噪音
可能的原因
-检测池脏
-检测器灯能量下降
-由泵引起的脉冲
-检测器上的温度效应
-检测池中有气泡通过
常见色谱故障-基线漂移
可能原因
-梯度洗脱引起
-流动相脏
-柱子没平衡
-系统中污染物溢出
RID检测器温度不稳定
常见色谱故障-鬼峰
鬼峰-没有进样就有色谱峰出现
原因-流动相脏,尤其是水相
常见色谱故障-双峰
柱头塌陷或柱床运动
泵头过滤芯部分堵塞
组分共流出
常见色谱故障-压力过高
可能原因
-柱子进口过滤芯被污染
Purge阀过滤芯被污染
色谱柱被污染
连接管路堵塞
进样器旋转密封阀被堵塞
进样针或者针座被堵塞
可用分段法来检查哪一段发生堵塞
常见色谱故障-压力过低
溶剂进口过滤芯被堵
连接管路泄漏或其他备件泄漏
溶剂或流速的改变
主动阀失灵
四元比例阀失灵
单向出口阀失灵
柱子失效(固定相流失)
常见色谱故障-压力波动
可能原因:
-溶剂进口过滤芯堵塞
-溶剂未脱气
-泵的密封圈老化
-出口单向阀失效
-主动阀失效
-最常见的原因失泵内有七宝
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