研究背景及理论基础：小麦条锈病是世界性流行的活体寄生的真菌病害，一直是威胁我国小麦安全生产的重要病害。尤其在今年（2020），小麦条锈病全国性大发生，为近10年之最，又一次为我们敲响警钟，对于这种类似新冠肺炎病毒通过气流传播的流行性病害要始终保持警惕（Wu et al. 2020）。自十八大报告提出生态文明建设以来，“绿色植保”、“绿色防控”在新形势下生态农业发展要求中应运而生。而培育、推广抗病小麦品种一直被认为是最为经济有效且绿色环保的防控措施。长期以来，病理学家、遗传学家、育种家投入大量精力寻找、发掘、创制优异的抗病资源，并应用到育种中。然而，由于条锈菌变异途径多，可通过突变、异核作用以及有性生殖创造出大量新毒性小种，常导致小麦抗病品种投入生产后往往不到几年时间，就很快“丧失”抗性。随着对该病害致病机理的探究不断深入，发现成株期抗病性往往具有持久性特点，目前克隆到的成株期抗病基因如Yr18、Yr36和Yr46，虽抗病机制不相同，但都参与能量代谢或糖转运，与衰老有关，且相对保守。除了Yr36来自野生二粒小麦以外，另外两个基因在中国春基因组中都具有相对完整的基因结构。受此启发，通过对中国春基因组目标区间内进行基因解析，可能会发现与成株期抗条锈病相关的候选基因。前人开展了大量的全基因关联分析（GWAS）模型、方法的探索，比如日本学者通过全基因组测序在水稻中开发了一种高效GWAS分析方法，它基于对每个核苷酸多态性的功能重要性进行评估，可以快速鉴定候选基因，而不需要额外的实验(Yano et al., 2016)。同样，在小麦中也已开展类似的研究，比如利用抗病R基因富集测序结合关联分析开展的小麦秆锈病R基因快速克隆(Arora et al., 2019)；利用外显子捕获测序结合关联分析快速检测小麦抗叶锈病基因的功能SNP变异（Liu et al., 2020）；以及利用高密度SNP芯片结合关联分析开展候选基因的发掘与功能验证等（Guo et al. 2018; Sun et al.,2020; Li et al., 2019; Rasheed et al., 2017）。本团队自成立抗病遗传小组以来，广泛对外收集小麦资源并进行多年多点的病害鉴定，经过十多年的努力，从5000多份世界小麦种质中，挑选出1500份对条锈病呈现不同程度的抗/感表型的多样性代表，并进行小麦高密度660K芯片扫描获得SNP基因型数据。另外，利用60多份普通小麦的重测序数据作为辅助（Cheng et al. 2019）。这为通过全基因组水平进行抗锈病基因位点的发掘、鉴定奠定了材料和数据基础。以上为本研究的开展提供了重要基础和理论思路。研究内容：1.初步定位本研究利用411份春小麦高代系材料，主要来自国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）和国际干旱地区农业研究中心（ICARDA），在杨凌、天水、江油经多年环境进行条锈病抗性鉴定，结合660K芯片基因型数据，通过全基因组关联分析快速发掘到292个与成株期抗条锈病表型显著关联SNP位点，其分布在19个位点区域中，其中有14个位点为已知的基因/QTL且被广泛利用在育种中（图1、图2）。
3.探索未知位点如是，利用这个分析思路，我们很快就对2BL上的位点进行了分析，不幸的是，这个位点在春小麦的群体中的区间较大，约4.8 Mb，而这个区间基本与我们之前利用双亲遗传群体所定位的YrSnb-2BL基本一致，二者得到了相互印证（Zeng and Wu et al. 2019）。该区间位于2B染色体长臂远端，按常理属重组交换热点区，但区间如此之大，说明该区段在CIMMYT和ICARDA材料中受到了强烈的人工选择从而导致连锁不平衡（LD）增大，而这一结果符合两个机构长期的一个育种目标（抗病、抗逆）。为了进一步缩小区域，我们利用另外一个较大的自然群体（来自世界各地的材料，个数超过1000），通过候选区域的关联分析，有效的将该区间缩小到612.9 kb，见图4（说实话还是很大，不过对于小麦，这个区间可以尝试分析了）。
图4 利用关联分析缩小YrSnb-2BL位点的候选区域为了寻找更多DNA变异，同样，利用63份普通小麦的重测序数据也进行了候选区间的关联分析，总共筛选到约800个多态性DNA变异（其中45个来自芯片，超过700个来自重测序），覆盖了该区间的12个高可信基因。进一步分析发现大部分显著的DNA变异都集中在三个基因周围，即TraesCS2B01G512900,TraesCS2B01G513000和TraesCS2B01G513100，但只在TraesCS2B01G513100的编码区发现3个显著性SNP变异（−log10P ≥ 4.85），这3个SNP的变异引起了氨基酸的改变。另外，还有4个显著性的SNP变异，其中2个位于TraesCS2B01G513000的启动子区域，另外2个分别位于TraesCS2B01G512900和TraesCS2B01G513100的下游，有趣的是，这3个基因都编码丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonineprotein kinases, STPKs），以往研究表明，STPK确实参与小麦对真菌病害的抗性反应（Cao et al. 2011）。4.锁定候选基因为了进一步确认候选基因，随后对候选区间的12个基因都进行了荧光定量PCR来分析它们在小麦成株期接种条锈后的表达情况，发现只有TraesCS2B01G513100在抗感对照中差异表达，表达量在24h和168h抗感间差异最大，分别是6倍和14倍。同时，利用已公布的小麦不同组织转录组数据，发现该基因在成株期的旗叶、穗子、芒的表达量较高，这符合田间成株期抗性的一般规律（Ramírez-González et al. 2018）。另外，利用小麦研究联盟的网站通过对四倍体Kronos突变体库分析，发现TraesCS2B01G512900、TraesCS2B01G513000和TraesCS2B01G513100存在多个突变位点，从中选取8个突变体（包括终止突变和错义突变），并连同野生型对其进行条锈菌接种验证，发现TraesCS2B01G513100中的两个突变体感病性要高于野生型，其他的无显著差异 （图5）。以上结果表明TraesCS2B01G513100很有可能就是参与条锈抗病反应的重要候选基因成员。
图5 YrSnb-2BL候选基因分析、初步验证和单倍型分析为进一步发掘TraesCS2B01G513100的其他关键变异，我们从Sunbird'S'/郑麦9023高代分离家系（HIF）群体中选出6个近等基因系，从412份GWAS群体中挑选64个育种高代系，进行PCR扩增测序并完成候选基因的关联分析。从20个DNA变异中发现一个错义突变SNP与表型有显著性关联。最后，针对612.9kb的候选区域进行了单倍型分析，共有4种单倍型，其中Hap-1和Hap-2与抗病有关，Hap-3和Hap-4与感病有关。而“TGCGGT”为该单倍型核心，为此又开发了相应的可供育种应用的KASP或dCAPS分子标记。TraesCS2B01G513100作为重要的参与小麦条锈抗性的目标基因，在育种中具有很大的利用价值，实际上，该位点在CIMMYT和ICARDA材料的频率已经很高（超过60%）。为进一步探究其抗病机制，目前大量的分子实验已经开展，期待有较好的结果。2020年7月17日《Plant Biotechnology Journal》杂志在线发表了西北农林科技大学植物免疫团队的题为“A large-scale genomic association analysisidentifies the candidate causal genes conferring stripe rust resistance undermultiple field environments”的研究成果(DOI: 10.1111/pbi.13452)。该团队的吴建辉博士、蔚睿硕士、王海英硕士为该论文的共同第一作者，康振生院士、韩德俊教授、曾庆东副教授为该论文的共同通讯作者。该项研究得到国家自然科学基金、博士后基金和开放课题等基金的资助。写在后面：“三人行，必有我师，择其善者而从之”。这是一个信息爆炸的时代，一个人的脑容量是有限的，以前发愁的是信息太少，现在发愁的是海量信息下如何快速筛选对自己有帮助的，只有和同行们多多学习和交流，才能找到一些答案。很幸运能有小麦研究联盟这个平台，我本身就是一个受益者，通过平台结识了很多朋友，这个工作的很多思路都来自于交流，特别感谢马省伟（南京农大）、李广伟（河南农大）、王萌（中科院土壤所）在工作思路上提供的建议，感谢台莉（西北农林）及师弟的女朋友在分子实验上的指导帮助，非常感谢吴佳洁和倪飞博士（山东农大）提供的Kronos突变体材料，同时也郑重感谢贾继增研究员提供的部分小麦验证群体的660K芯片数据，以贾老师等为代表的老前辈对我们后生的支持和关爱是我们前进的动力之一！“学而不思则罔”。文章虽发，算是对工作的一个阶段性总结。但必须认识清楚，该工作仍存在不足，比如分子实验上的证据不够充分，对于后面的抗性机制也需要进一步探究。在这里，也要感谢两位审稿人和编辑，在审稿期间提了很多补充分子实验的建议，并肯定了这个工作。说到实验，一直在考虑，这3个候选基因都是STPK，且成簇分布，是否都存在功能，保证了这个位点的持久抗性？（虽然目前的证据显示可能只有一个参与抗性，但不能完全排除其他两个）这不是无中生有，之前武汉大学何光存老师的那篇抗稻飞虱基因，就是NLR成簇分布，且都起作用，保证了含有该位点的水稻材料持久抗性的特性。很显然，这个问题值得探究，路还很长……“术业有专攻”。顺便说一句，本文的英文修改是在投必得公司帮助下完成的，虽然收费高一些，但确实很专业，投稿之后没有遇到语言的问题，在这里给他们公司的专业老师点个赞，后面会继续与他们合作。参考文献：Arora S, et al. (2019) Resistance gene cloning from a wild crop relative by sequence capture and association genetics. Nature Biotechnology37:139-143.Cao A, et al. (2011) Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA108:7727-7732.Chen J, et al. (2019) Genome‐wide association study of six quality traits reveals the association ofthe TaRPP13L1 gene with flour colour in Chinese bread wheat. Plant Biotechnology Journal17:2106-2122.Cheng H, et al. (2019) Frequent intra- and inter-species introgression shapes the landscape of genetic variation in bread wheat. Genome Biology20:136.Guo Z, et al. (2018) Genome-wide association analyses of plant growth traits during the stem elongation phase in wheat. Plant Biotechnology Journal16:2042-2052.Kourelis J and van der Hoorn RA L (2018) Defended to the nines: 25 years of resistance gene cloning identifies nine mechanisms for R protein function. The Plant Cell30:285-299.Liu F, et al. (2020) Exomeassociation analysis sheds light onto leaf rust (Puccinia triticina) resistance genes currently used in wheat breeding (Triticum aestivum L.). Plant Biotechnology Journal18:1396-1408.Ramírez-González R H, et al. (2018) The transcriptional landscape of polyploid wheat. Science361:r6089.Sun C, et al. (2020) The wheat 660K SNP array demonstrates great potential for marker-assisted selection inpolyploid wheat. Plant Biotechnology Journal18:1354-1360.Wu J, et al. (2020) Association analysis identifies new loci for resistance to Chinese Yr26-virulentraces of the stripe rust pathogen in a diverse panel of wheat germplasm. Plant Disease104:1751-1762.Wu J, Yu R, Wang H, et al. (2020) Alarge-scale genomic association analysis identifies the candidate causal genes conferring stripe rust resistance under multiple field environments [published online ahead of print, 2020 Jul 17]. Plant Biotechnol J. doi:10.1111/pbi.13452Zeng Q, Wu J, et al. (2019) Amajor QTL co-localized on chromosome 6BL and its epistatic interaction for enhanced wheat stripe rust resistance. Theoretical and Applied Genetics132:1409-1424.原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13452
