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The Immune Microenvironment and Neoantigen Landscape of Aggressive Salivary Gland Carcinomas Differ by Subtype侵袭性唾液腺癌中不同亚型的免疫微环境和新抗原景观

一、研究背景

唾液腺癌（SGC）是罕见的侵袭性癌症，复发率高且远处转移多见，目前面对这种高侵袭性肿瘤的临床疗法较少。尽管临床数据不多，目前显示出该肿瘤对于免疫检查点相关的免疫疗法反应率很低。为了提高治疗效果，需要对这种癌症的相关分子改变和免疫学过程有更全面的了解。

二、研究思路

三、结果解析

1、SCG中的免疫浸润与活性分析（Deconvolution of immune infiltration and activity in SGCs）

作者对76个唾液腺肿瘤的队列进行了分析：20个ACC，40个MECA和16个SDC。表1和附图表S1显示了包括治疗方式和既往病史在内的临床和病理特征。

表1：从患者获得的唾液肿瘤的临床和病理特征

作者对肿瘤进行了RNA测序（RNAseq），并使用几种方法分析了标准化数据以量化和解卷积免疫浸润，包括CIBERSORT，ESTIMATE，单样本基因集富集分析（ssGSEA）和细胞溶解性（CYT）评分（补充表S1）。

附表1（部分）：患者样本的各指标评分状况

为了了解唾液腺癌的免疫情况，作者将SCGs中观察到的免疫浸润情况与TCGA中的其他癌症样本进行对比

图1A：不同肿瘤之间免疫分数的对比

  • ACC和MECA始终表现出相对免疫耗竭的微环境。另一方面，SDC通常具有更高的免疫浸润性，与在透明细胞肾癌和非小细胞肺癌中观察到的水平相当（图1A）。

作者测量了免疫细胞浸润和体细胞肿瘤突变负担（TMB）以反映免疫相关信息和新抗原状况的各个方面，获得并预测免疫检查点抑制剂治疗反应的信息。并计算了免疫浸润（IIS：immune infiltration ）和T细胞浸润（TIS：T cell infiltration ）得分：IIS是先天和适应性免疫得分的总分，而TIS是9种T细胞亚型的总分。

图1B：CYT分数和肿瘤突变负担（TMB）的情况 
图1C：不同癌症中IIS和TMB的状况。

  • 与其他类型的癌症相比，ACC和MECA肿瘤的免疫浸润和TMB普遍较低。相反，SDC具有更高的TMB和免疫浸润水平，尽管与其他癌症类型相比水平中等（图1B，C）。

作者随后通过基于不同方法衍生的免疫评分，对76个SGC样品进行无监督的分级聚类，并进行单独比较，揭示了免疫水平不同的cluster（图2A）

图2A：根据不同RNA-seq计算得的免疫浸润指标聚类热图

  • 几乎所有SDC肿瘤（16例中有15例，占94％）都位于免疫丰富的簇中。大多数ACC（20个中的16个，占80％）处于免疫不良的簇中，而MECA分布在两个簇中的范围更广。

图2B：不同癌症亚组之间的TIS评分 
图2C：不同癌症亚组之间的CYT评分

  • 在三种SGC组织学中，SDC通常具有显著更高的T细胞水平炎症（TIS）和T细胞溶细胞活性（CYT评分）（SDC与ACC或MECA的p值≤0.001，图2B，C）。其他免疫指标中（IIS，ESTIMATE Immune Score ，CIBERSORT）也观察到相同的结果。

2、RNAseq和IHC展示的免疫表型比较

为了确定根据RNAseq结果计算的肿瘤免疫指标是否与唾液肿瘤中免疫细胞浸润的组织学评估相一致，作者系统地检查了每种技术的方法间一致性。

附图2：根据RNAseq数据计算的肿瘤免疫指标相关性

  • 在样本中，RNAseq衍生的免疫指标（CIBERSORT，ESTIMATE，CYT和ssGSEA）彼此之间密切相关（Spearman r = .73-.95，p <.0001，附图2）。

在16个免疫组织化学（IHC）分析的病例中，作者进行了针对CD45和CD3的IHC染色，包括相应的阴性对照。作者发现：

附图3：根据RNAseq数据计算的肿瘤免疫指标与免疫组化结果的相关性（spearman非参数检验）

  • IHC和RNAseq计算得到的IIS的测量值之间有着很强的相关性（Spearman r = .67，p = .005）

  • TIS评分证明了RNAseq的高度有效性（CD3 +细胞-TIS；Spearman r = .63，p = .008）（附图3）。

  • 这些相关性表明，在SGC肿瘤中，RNAseq计算的数值以一致且可再现的方式测量肿瘤免疫微环境的各个方面，并且可以代表用IHC观察到的白细胞浸润。

3、肿瘤中免疫浸润的细胞群和免疫检查点

图3A：ssGSEA算法分析来自76个SGC肿瘤的RNAseq数据得到的各个指标聚类（spearman非参数检验）

  • SDC总体上具有相对较高的浸润率，几乎具有所有免疫细胞亚群，并且T细胞检查点的表达水平较高（图3A）。

在附图4中，作者对免疫细胞亚群进行了更详细的分析，结果显示出类似的趋势。

附图4（部分）：不同癌症亚组的ssGSEA指标得分箱线图

  • SDC中的免疫细胞水平最高，而ACC中的免疫细胞水平最低。

抗原加工/呈递机制的活性结果在SDC中得分最高（APM1和APM2，用ssGSEA定量，图3A-B）

图3B：APM得分与TIS之间线性相关程度 
图3C：不同癌症亚型的APM得分情况

  • APM分数由七个基因确定：HLA-A / B / C，B2M，TAP1，TAP2和TAPBP37。APM评分与T细胞浸润密切相关（Spearman r = .84，p <.0001；图3B），与CD8 + T细胞通过分泌IFNγ上调APM表达的能力相一致。

通过检查突变负荷和抗原呈递的组合，作者发现ACC的各项指标最低，表明这些肿瘤的抗原可利用性和呈递水平非常低（附图5）。

附图5：免疫指标，突变负荷和抗原呈递之间线性判别分析

高度T细胞浸润的癌症通常能够逃脱免疫监视，因为组成T细胞处于失能状态。因此，作者检查了免疫高-低组和免疫低-SGC和整个组织学中T细胞检查点的表达。

作者发现：

附图6：不同免疫评分分组的免疫检查点基因表达情况

  • 与免疫评分低的肿瘤相比，所有这些检查点在免疫评分较高的唾液肿瘤中的表达水平显著较高：

    • 最显著的差异是PD1，CTLA4，LAG3，TIM3和TIGIT表达（附图6）。

附图7：不同组织学亚型中的免疫检查点基因表达情况

  • 根据三种不同的组织学亚型，SDC比ACC和MECA具有更高的这些T细胞检查点表达（图3A和附图7）。

作者使用了T细胞功能障碍的正交测量方法（TIDE，Tumor Immune Dysfunction and Exhaustion），这个算法使用了独特的基因特征，包括TGFB1，SOX10和其他独立发现的基因来计算调节T细胞活性对临床结果的影响。

图3D：不同亚型的TIDE得分情况

  • SDC具有比MECA或ACC高得多的T细胞功能障碍得分（所有p <0.01；图3D）。

与高免疫浸润的肿瘤通过致使T细胞失能达到免疫逃逸相反，更多的免疫耗竭的肿瘤可能会通过排除T细胞而实现免疫逃逸。

为了检查SGC中的这些可能机制，作者使用TIDE分析了基于转录组的T细胞排斥基因signature。

附图8A-C：根据免疫评分分组的SGCs的TIDE评估得分情况

  • 免疫评分低的SGC具有显著更高的T细胞排斥评分（p = 0.0002），与更高水平的髓样抑制细胞浸润（MDSCs; p <.0001）和M2极化的肿瘤相关巨噬细胞浸润相关（p  <.0001）（附图8A-C）。

附图9：ACC样本中基于免疫评分分组的TIDE相关评分情况

  • 在ACC中，更高水平的髓样抑制细胞浸润（MDSCs）和M2极化的肿瘤相关巨噬细胞浸润（TMM2）相关的表型更加明显（附图9）

图3E：不同组织学亚型的MDSC得分 
图3F：不同组织学亚型的TAM M2得分

  • 与MECA和SDC相比，ACC显示出更高水平的MDSC和M2巨噬细胞浸润（图3E-F），T细胞排斥没有显著差异。

作者认为，这些数据揭示了唾液肿瘤中起作用的几种关键的免疫逃逸机制。

  • SDC具有高的新抗原负荷，并具有高度的免疫浸润能力，但T细胞功能障碍水平高。

  • 在免疫频谱的另一端，ACC的特征是非常低的新抗原负荷，T细胞排斥表型以及微环境由更多免疫抑制性MDSC和M2巨噬细胞组成。

  • MECA的异构性更高，代表了整个免疫谱，具有更多的中间突变负荷。

4、免疫浸润与侵略性的临床行为相关

为了确定肿瘤微环境中T细胞浸润的水平是否与临床结果相关，作者比较了最终发展为复发（局部或远处）的SGC和未复发的SGC。

图4A：复发性和非复发性SGC的T细胞浸润（TIS评分）

  • 与非复发/转移病例相比，复发/转移性SGC的T细胞浸润水平显著降低（p = 0.02，图4A）。

图3B:组织学亚型分组后复发与非复发的TIS评分

  • 在组织学亚型中，ACC（p =0 .008）和MECA（p = 0.005）的分析中可以观察到这种关系，而在SDC（p = 0.31，图4B）中则没有观察到这种关系。当使用IIS进行免疫浸润的比较时，结果与TIS评分相似。

这些数据证明了作者的假设：免疫浸润程度低的微环境导致的缺乏免疫监测，可能与ACC和MECA肿瘤在最初治疗后发生复发或远处转移的能力有关。

作者还检查了免疫与良性腺瘤癌变之间的关系。有研究指出，唾液腺的长期良性多形性腺瘤可引起行为特别具有侵略性的涎腺癌，称为“多形性腺癌（ex-PA）”。SDC和MECA是ex-PA最常见的两种恶性进展。在该队列中，16个SDC中的6个（37.5％）和40个MECA中的24个（60％）源于先前存在的多形性腺瘤。

附图12：原发SDC与ex-PA起源的SDC中CD8+T细胞评分的比较。

  • 作者观察到，多形性腺瘤起源的SDC的IIS和TIS均比原发性SDC的要低得多（分别为p = .04和p = .03；附图11A-B）。这种差异主要是由多形性腺瘤起源的SDC中CD8 + T细胞的水平降低所致（p = .04；附图12）。

附图11：与相同组织学分化的肿瘤相比，多形性腺瘤来源的SDC或MECA中的差异性免疫浸润模式

  • 在MECA中，虽然IIS和TIS在多形性腺瘤起源的肿瘤中的数值较低，但这些差异在统计学上并不显著（分别为p = .09和p = .11；附图11C-D）。

5、免疫浸润差异的SGC参与的经典通路

作者检查了在免疫评分分组之间的肿瘤之间差异激活的转录程序（如图2A所示）。在三种SGC组织学中，作者比较了具有最高和最低IIS值的样本的转录组。IPA（ Ingenuity Pathway Analysis，Qiagen）用于鉴定丰富的经典途径。

图4C：不同组织学亚型分组的基于差异表达基因富集的经典通路venn图。

  • 在免疫分组的肿瘤显著富集的通路中，有7种通路在所有3种SGC组织学中均富集（图4C）。

图4D：三种唾液癌共有的7种富集途径的富集得分对比

  • 与ACC相比，免疫相关通路在SDC和MECA的富集程度（通过-log10 p值测量）要高得多（图4D）。

6、新抗原景观和HLA丢失

作者在36例病例中（8个ACC，12个MECA，16个SDC）使用外显子组测序，并使用netMHCpan预测了与患者特异性HLA I类结合的体细胞突变和突变衍生抗原。

基因融合可以产生免疫原性新抗原并且在唾液腺癌中特别常见，是ACC和MECA中常见的致癌性改变。对SGC中的RNAseq数据进行分析后，发现49例患者（19 ACC，14 MECA和16 SDC）存在基因融合导致的新抗原，这些抗原预计会结合患者特异性的I类HLA。作者在补充表S9中展示了每个样品的SNV和融合相关的新抗原计数。

附图5：A-E各项免疫浸润指标与新抗原及SNV计数关系 F：SNV与SNV变异新抗原关系

  • 如预期的那样，由错义突变产生的新抗原的数量（单核苷酸变异新抗原，SNV-NeoAg）与肿瘤中的SNV的数量紧密相关（Spearman r = .82，p <.0001；附图5）。SDC的SNV-NeoAg水平最高，而ACC的最低（p = .002）。

图5A：不同组织学亚型中的融合衍生抗原及单核酸变异新抗原计数比较

  • 融合衍生的新抗原（Fusion-NeoAg）的数量往往低于SNV-Neoag的数量。SDC融合新抗原计数最高，而MECA最低（p = .02；图5A）。

作者分析了新抗原景观和免疫微环境之间的关联。

图5B：TIS和SNV计数的相关性

图5C：TIS和SNV-NeoAg计数的相关性

  • SNV负荷与T细胞（Spearman r = .48，p = .003，图5B）和免疫（Spearman r = .52，p = .001）浸润相关。预测的SNV-NeoAg丰度与TIS（Spearman r = .32，p = .052，图5C）和IIS（Spearman r = .34，p = .039，附图5B，见上）的相关性略有减弱，但具有相似的相关性。

  • 由于SNV计数和免疫浸润均因组织学而异，因此作者进行了多变量分析，以检查SNV-新抗原计数与免疫指标之间的关系，并调整了肿瘤组织学。SNV-新抗原计数与ESTIMATE，CYT，IIS和TIS评分之间的关联仍然很显著，与肿瘤组织学无关（对于所有回归模型，r方> .35，p <.02）。

图5D：TIS和Fusion-NeoAG计数的相关性

  • 在融合新抗原计数和免疫浸润之间观察到相似的关联（图5D），在ACC肿瘤内见到最强的关联（附图5）。这些关联表明，在这些SGC组织结构中，突变负荷非常低（ACC，MECA）或中等（SDC），肿瘤微环境中的免疫浸润程度似乎与衍生出两种新抗原的大量新抗原相关。来自突变或基因融合。

  • 这表明这些肿瘤的新抗原格局会影响免疫监视：对于那些新抗原很少的肿瘤来说，其抗肿瘤免疫反应极小。

  • 由于这些原因，具有低突变负荷并因此具有低的新抗原负荷的唾液癌似乎也对免疫检查点抑制剂起反应的准备最少，至少作为单一疗法。

最后，作者检查了SGCs是否利用了HLA的丢失，这会削弱呈现多种新抗原库的能力，以此增强免疫逃避的能力。

通过使用FACETS，在正常DNA的外显子组测序数据中检测每种情况下均在HLA I类基因座等位基因特异性拷贝数，作者确定了哪些病例携带单拷贝HLA丢失（杂合性或拷贝中性丢失）或至少一个有纯合的HLA I类等位基因。

附图13：ACC（A），MECA（B）和SDC（C）的HLA I类损失患病率

  • 该分析表明，HLA LOH /纯合性在ACC（44％）和SDC（31％）肿瘤中普遍存在，但在MECAs中不常见（8％；附图13）。

作者假设某些SGC，尤其是ACC，可能利用HLA丢失作为免疫逃逸机制。这些发现是初步的，需要进行大量样品进一步分析以确认。

小结

作者在这篇文章采用了多种方法来评估自身唾液腺癌样本的免疫浸润情况，并且将免疫浸润与肿瘤抗原联合进行分析，向读者展现了唾液腺癌这一较为罕见癌症的免疫微环境特性。

在免疫的相关分析模块，作者除了通过基于RNA-seq数据的算法分析，还结合了增加了免疫组化进行相关指标的验证；除了常见的免疫评分分组和组织学分组，作者还根据肿瘤的起源情况进行了相关的分组，以进行免疫微环境分析。在肿瘤抗原模块，作者对部分样本进行了WES，揭示了唾液腺癌HLA相关基因的变异情况。

研究的局限主要在于仅选择了临床上最具侵略性的SGC类型，没有剖析临床上侵略性较弱的SGC类型，例如粘液表皮样或多形性腺癌。

还是和往常一样，点击原文链接，即可获取今天小编为大家解读的文献。本期的分享就到这里啦，一起期待下一期的精彩分享吧~

编辑：虾仁饭

校审：炒年糕 糯米饭

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