一文读懂溶瘤病毒疗法：溶瘤病毒与免疫，以及产业开发
在肿瘤细胞内复制、选择性地感染肿瘤细胞继而杀死肿瘤细胞的溶瘤病毒疗法是目前最有希望的肿瘤免疫治疗方法之一。溶瘤病毒疗法利用基因工程的手段对溶瘤病毒进行改造，使其失去毒性并保留病毒的复制能力，靶向地递送到肿瘤细胞处，杀伤肿瘤细胞，达到治疗的目的。
当癌细胞在病毒的感染下破裂死亡时，新生成的病毒颗粒会被释放，进一步感染周围的癌细胞。从机理上看，它不仅能对肿瘤进行直接杀伤，还有望刺激人体的免疫反应，增强抗肿瘤效果。为了让溶瘤病毒有效地针对癌细胞，对肿瘤的特异性靶向是研发中的一大重点。有趣的是，肿瘤天生就很适合成为溶瘤病毒的攻击对象——当诸如RAS、TP53、RB1、以及PTEN等基因出现变异后，癌细胞的抗病毒感染能力会变弱，给了溶瘤病毒可乘之机。
目前常用的病毒包括腺病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、呼肠孤病毒、细小病毒、新城疫病毒、柯萨奇病毒等。水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）和马拉巴病毒（Maraba virus）等经过改造的弹状病毒（rhabdoviruses）能依赖干扰素信号通路的缺陷，特异性地靶向癌细胞。而首款得到美国FDA批准治疗黑色素瘤的溶瘤病毒，则是由单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）改造而来。这些病毒的设计都与免疫反应有关。
另一些溶瘤病毒则能额外针对恶性肿瘤的代谢异常。比如pexastimogene devacirepvec（Pexa-Vec）自身带有一个缺陷的胸苷激酶基因，因此它只能在具有过量胸苷激酶活性的癌细胞中复制。
此外，这款病毒中的B18R基因带有一个提前的终止密码子，让它的编码蛋白不容易被干扰素识别与结合。这些特性让此类病毒能有效地针对肿瘤细胞，而将对正常细胞的影响降至最低。
我国是研究溶瘤病毒较早的国家之一，早在2003年和2005年，CFDA就批准了两款溶瘤病毒产品上市，分别是赛百诺的今又生和三维生物的安柯瑞（H101）。但这两款产品至今还未得到国际认可。
目前只有一款Amgen（安进）公司的T-vec（Imlygic，I型单纯疱疹病毒）获得FDA批准，用于黑色素瘤患者的局部治疗，是首个获得FDA批准的溶瘤病毒治疗药物。
一、溶瘤病毒与免疫
T细胞想要触发成功的抗肿瘤反应，必须得经历四个关键步骤。而溶瘤病毒能在这四个步骤中对T细胞进行协助。
1. T细胞致敏（T cell priming）
T细胞反应的启动，离不开对特定抗原表位的识别，而这个复杂过程离不开抗原呈递细胞的工作。在癌症中，抗原呈递的过程往往会受到负面影响，让肿瘤在免疫学上“冷下来”。而溶瘤病毒可以实现类似于“疫苗”的作用，促进肿瘤相关抗原的呈递与识别。
正如上文中提到的那样，局部的溶瘤病毒治疗，可以通过裂解癌细胞，释放出大量肿瘤相关抗原，并创造一个亲免疫的细胞因子环境，便于抗原呈递细胞实现它们的功能。这一设想已经在不少实验中得到了验证。
一些研究人员发现，脊髓灰质炎病毒（poliovirus）与弹状病毒的嵌合能导致肿瘤抗原的释放，并催生I类干扰素反应。这些刺激最终会诱导肿瘤特异的T细胞群体增生。
研究人员们指出，这一方法的优点在于，我们不需要对肿瘤相关抗原有事先的了解，因此是一种简便的个体化疫苗开发手段。但我们也要注意，此类方法未必能诱导足够的T细胞反应。为此，研究人员认为在溶瘤病毒中加入肿瘤相关病毒载体，或许能提高效果。
溶瘤病毒的多种作用机制
2. 移动与浸润（trafficking and infiltration）
在循环中的T细胞能移动到肿瘤位点进行浸润，对患者的预后有举足轻重的作用。而溶瘤病毒的使用，有望增强T细胞对肿瘤的浸润。这背后有着多种潜在的机制。
首先，病毒感染能激发潜在的I类干扰素反应，刺激趋化因子的生成，从而募集T细胞。在动物模型中，无论是腺病毒、HSV-1、牛痘病毒、还是新城疫病毒（Newcastle disease virus），都能有效地提高T细胞的浸润。
此外，溶瘤病毒在临床试验中，也证实能在黑色素瘤与其他晚期癌种里，提高T细胞的浸润。而对于大脑肿瘤，科学家们也同样在一些研究中观察到了积极的成效。
其次，溶瘤病毒能诱发TNF、IL-1β、以及补体的反应，上调内皮细胞上选择素的表达，为T细胞的浸润提供关键信号。
第三，溶瘤病毒通过改造，有望针对特定的致癌信号通路。举例来说，WNT–β-catenin通路具有免疫抑制的效果，且能抑制细胞的抗病毒反应。通过改造，不少溶瘤病毒能被β-catenin信号通路激活，促进肿瘤特异的病毒复制与抗肿瘤效果。
第四，溶瘤病毒能编码T细胞趋化剂，有望直接招募T细胞，而不必担心肿瘤环境中的趋化因子表达缺陷。
在这篇综述中，研究人员们也指出，肿瘤病毒也能协助克服组织结构上的障碍，进一步帮助T细胞浸润。比如它能够吸引嗜中性粒细胞在肿瘤微环境中释放炎性介质（inflammatory mediators）以及带有细胞毒性和细胞外基质（ECM）降解属性的蛋白酶。
3. 规避免疫抑制（circumventing immune suppression）
即便T细胞成功在溶瘤内取得了浸润，依旧不代表它们就能有效对肿瘤展开攻击。研究人员们指出，在进入到肿瘤后，T细胞依然需要克服环境中具有免疫抑制性的分子，如IL-10、TGF β、以及IDO。
在这方面，溶瘤病毒有望诱导亲炎性辅助T细胞1（pro-inflammatory T helper 1），从而改变抑制性的肿瘤微环境。此外，它也有望直接杀死免疫抑制性的细胞。
其中，最受人关注的一点可能就是溶瘤病毒将“冷肿瘤”变成“热肿瘤”的能力了。在一项研究中，研究人员们先移除了三阴性乳腺癌患者的肿瘤，并在原位植入了次代肿瘤。
后续发现表明，溶瘤病毒的使用让T细胞对肿瘤抗原产生了反应，且能防止肿瘤复发。而且免疫检查点抑制剂的使用，还能进一步增强治疗的效果。其他的一些临床前试验也证明了溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂联用的潜力。
在临床试验中，这一潜力再次得到了验证。无论是PD-1抑制剂，还是CTLA4抑制剂，在与talimogene laherparepvec联用的情况下，均能提高患者CD8与CD4阳性T细胞的数量，表明可能带来了系统性的免疫效应。
尽管这项试验尚处于1期，但针对晚期黑色素瘤的总体缓解率达到了62%，完全缓解率达到了33%。
此外，免疫细胞浸润性低的患者，也同样取得了良好的效果，表明在溶瘤病毒的作用下，“冷肿瘤”对免疫检查点抑制剂也产生了响应。这篇发表在《细胞》上的研究也因此引起了大量关注。
除了让肿瘤从“冷”变“热”外，现有的一些研究也在尝试用溶瘤病毒递送免疫检查点抑制剂的做法。这一做法需要在溶瘤病毒中编码免疫检查点抑制剂，从而避免联合疗法带来的毒性。另外，溶瘤病毒对癌细胞的特异性，能更有的放矢地在正确的地点释放药物。目前，已经有两项研究进行了初步的尝试。但我们也要承认，这个想法在技术与机制上还有不少挑战有待解决。
4. 结合肿瘤细胞（engagement of tumour cells）
成功免疫疗法的最后一步，在于T细胞对肿瘤细胞的识别、结合、以及攻击。为了躲避T细胞的识别，肿瘤细胞能下调参与抗原呈递的通路和I类MHC。而溶瘤病毒有望对其进行一定程度的逆转。举例来说，呼肠孤病毒（reovirus）能增加I类MHC与/或II类MHC在肿瘤细胞与抗原呈递细胞上的表达。类似的，被HSV感染的肿瘤细胞能促进树突状细胞的成熟与II类MHC的表达。
研究人员们还指出，溶瘤病毒有望用一种全新的方法去促进T细胞与肿瘤细胞的结合。目前，有一类叫做双特异性T细胞结合子（Bispecific T cell engagers，BiTE）的分子能结合CD3等激活T细胞的分子，且结合癌细胞表面的抗原靶点。这类创新疗法在血液癌症的治疗中取得了积极的成果，但在实体瘤中的应用却可能受到肿瘤微环境和/或脱靶副作用的限制。编码BiTE的溶瘤病毒有望解决这些瓶颈。
在一项早期研究中，一款能直接结合EPHA2与CD3的BiTE被整合进入了溶瘤病毒，并能在肿瘤细胞处释放BiTE，对未被病毒感染的癌细胞也产生杀伤。另一项研究里，结合EpCAM与CD3的BiTE也能在组织活检样本中激活T细胞。
瘤内注射编码IL-7和IL-12的溶瘤病毒可增加免疫检查点抑制剂的抗肿瘤疗效
肿瘤微环境中的免疫状态是确定免疫疗法抗肿瘤有效性的关键指标。已有数据支持肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的激活和增殖在提高利用免疫疗法给实体肿瘤患者带来的治疗益处中的作用。
在一项新的研究中，为了进一步提高溶瘤病毒的抗癌潜力，来自日本鸟取大学和安斯泰来制药公司（Astellas Pharma Inc.）的研究人员对溶瘤牛痘病毒进行基因改造，使得它们递送两种细胞因子--- IL-7和IL-12，以帮助刺激抗肿瘤免疫反应。相关研究结果发表在2020年1月15日的Science Translational Medicine期刊上，论文标题为“Intratumoral expression of IL-7 and IL-12 using an oncolytic virus increases systemic sensitivity to immune checkpoint blockade”。论文通讯作者为安斯泰来制药公司的ShinsukeNakao。
图片来自Science Translational Medicine, 2020, doi:10.1126/scitranslmed.aax7992。
Nakao及其研究团队发现将编码IL-7和IL-12的肿瘤选择性溶瘤牛痘病毒（oncolyticvaccinia virus）瘤内注射到具有免疫活性的荷瘤小鼠中可激活之前免疫原性较差的肿瘤中的炎性免疫状态，甚至导致肿瘤完全消退，即便是针对在远处堆积的肿瘤，也是如此。
实现肿瘤完全消退的小鼠当再次遭受相同的肿瘤细胞攻击时产生抵抗力，这表明它们建立了长期的肿瘤特异性免疫记忆。
在对免疫检查点抑制剂抗PD-1抗或抗CTLA4抗体单一药物无反应性的肿瘤模型中，相比于仅使用这种病毒疗法，将这种病毒疗法与抗PD-1抗或抗CTLA4抗体联合使用可进一步提高抗肿瘤活性。
这些发现表明瘤内注射携带编码IL-7和IL-12的基因的溶瘤牛痘病毒通过改变肿瘤微环境中的免疫状态，在直接注射这种溶瘤牛痘病毒的肿瘤和远处的未注射这种溶瘤牛痘病毒的肿瘤中都具有抗肿瘤活性，从而使得肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感。
Nakao团队也在携带人癌细胞的人源化小鼠中观察到了肿瘤内IL-7和IL-12表达的益处。这些数据支持对未发炎的实体瘤患者开展进一步研究。
二、我国溶瘤病毒的产业开发概况
在我国，众多企业处在临床开发阶段，进展比较快的包括复诺健、亦诺微、天士力创世杰、滨会生物、威溶特、养生堂、锤特生物等进入临床阶段或已获IND受理。
我国部分溶瘤病毒项目临床试验进展情况
我国各公司的溶瘤病毒改造策略
2019年10月，养生堂获批了一款溶瘤病毒的临床试验申请。该药物是由疱疹病毒改造的，2018年6月，由万泰生物及其子公司万泰沧海转让而来。
北京奥源和力独立开发了拥有自主知识产权的重组人GM-CSF单纯疱疹病毒注射液（OrienX010），OrienX010对单纯疱疹病毒HSV-1进行了改造，删除致病基因，并插入了编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的DNA片段，使其在肿瘤细胞中特异性复制，从而杀死肿瘤细胞，并通过表达GM-CSF蛋白激活全身抗肿瘤抗原的特异性免疫反应，发挥更大的肿瘤免疫反应。
深圳亦诺微医药科技有限公司自主研发的溶瘤病毒产品T3011（瘤内注射）是新一代重组疱疹溶瘤病毒。同时携带PD-1抗体和白介素12（IL12）的基因，经瘤内注射进入肿瘤组织，2020年5月30日，T3011（瘤内注射）获美国FDA临床批准，之前该产品在中国（2019年7月）和澳洲（2019年9月）启动临床I期，是全球首个在中、美、澳三国同期开展临床试验的溶瘤病毒。
滨会生物核心产品“重组II型单纯疱疹病毒注射制剂（OH2）” 2018年获得国家药品监督管理局颁发的临床批件。该药品由刘滨磊博士负责研发，是在野生型2 型单纯疱疹病毒株（herpes simplex virus type 2，HG52）的基础上剔除了免疫抑制基因和毒性基因，并插入hGMCSF的表达序列，插入hGM-CSF 基因片段的OH2。目前已开展多项与PD-1/L1的联合疗法试验。
复诺健自主研发的新一代重组单纯疱疹溶瘤病毒VG161，基于改构的I型单纯疱疹病毒骨架，创造性的同时携带了四个免疫调控因子。2019年10月22日正式获得澳洲监管部门OGTR颁发的临床研究许可。
安科生物的ZD55-IL-24由元宋生物转让，目前在IND阶段。ZD55-IL-24是是E1B55KD区域被特异表达框替代的重组人5型腺病毒，在克隆位点上插入抗癌基因 IL-24，实现了癌症的靶向基因-病毒治疗策略。
基于痘病毒的溶瘤病毒改造
天士力创世杰T601具有完全自主知识产权的治疗用生物制品1类新药，采用了法国生物技术公司Transgene的TG6002产品的技术，具备靶向溶瘤和靶向化疗的双重作用。T601是经改造的牛痘病毒，具有双基因缺失（TK-RR-）并在其感染的癌细胞中表达自杀基因FCU1，从而局部产生5-FU。2019年4月17日，T601在中国获得临床批件，针对适应症为消化道恶性肿瘤。
2009年，李氏大药厂从Jennrex获得Pexa-vec（JX-594）在中国大陆、香港和澳门的独家许可。Pexa-vec是设计阻断胸苷激酶（TK）基因及插入GM-CSF和大肠杆菌β-半乳糖苷酶（Lac-Z）的牛痘病毒，使得Pexa-Vec能选择性地在癌细胞内复制并破坏癌细胞，同时刺激机体抗肿瘤免疫应答。
基于腺病毒的溶瘤病毒改造
三维生物是我国最早研发溶瘤病毒的公司之一，旗下安柯瑞于2006年7月正式上市销售。安柯瑞是利用基因工程技术删除人5型腺病毒E1B-55kD基因片段和E3-19KD基因片段后重新获得的一种溶瘤腺病毒，其在p53基因缺乏或异常的肿瘤中能特异性复制并产生复制依赖性细胞毒作用，而对正常人体细胞无明显的细胞毒作用。用于治疗头颈部肿瘤、肝癌、胰腺癌、宫颈癌等多种适应症。
赛百诺的今又生是一种经基因工程改造、具有感染活性的重组人p53基因腺病毒颗粒（rAd-p53），由复制缺陷性人类5型腺病毒和正常的p53肿瘤抑制基因两部分组成，复制缺陷性腺病毒颗粒作为载 体把p53基因带入肿瘤细胞，p53基因在肿瘤细胞内表达为p53蛋白发挥抑制肿瘤细胞生长、引起肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤组织血管再生和旁观者效应等生物学功能。
深圳市天达康基因工程有限公司的溶瘤病毒产品ADK-TK（腺病毒）目前正开展一项针对进展期肝癌肝移植的III期临床实验。该产品已5型重组腺病毒为载体，将胸苷激酶基因（TK）转入肿瘤细胞表达，在更昔洛韦（GCV）参与下，胸苷激酶将单磷酸核苷转化为三磷酸核苷，与肿瘤细胞新生DNA链结合，干扰DNA合成，产生“自杀效应”，从而起到杀伤肿瘤的作用。
贵州百灵的EDS01 2016年9月由成都恩多施转让，目前正在进行临床II期实验，适用于头颈部恶性肿瘤淋巴结转移的治疗。EDS01是E1B55KD敲除的腺病毒，可以特异性在P53缺失的肿瘤中复制，并插入人内皮抑素endostatin，抑制肿瘤血管生成，阻断其营养供应。
成都康弘生物科技有限公司是康弘药业集团的全资子公司，于 2005 年 12 月成立。其产品KH901是一种特异性溶瘤重组腺病毒注射液，能通过溶细胞效应直接杀死肿瘤细胞产生局部的抗肿瘤效应，而且也能表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)，刺激免疫反应产生抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长及转移。2005 年，KH901获该药物的临床批件。
锤特生物独立开发的国家I类新药BioTTT001能与IL-12协同作用，杀伤未被病毒感染的远处肿瘤细胞，包括转移的微小肿瘤细胞灶。该病毒载体为C 亚类的5 型腺病毒Ad5，经删除E1A-CR2、E1B19K 和E3gp-19K 三个基因，并利用E3gp-19K 启动子控制表达人IL12 的p35 和p40 亚基基因序列。2020年7月10日，BioTTT001的临床实验申请获得受理。
基于呼肠孤病毒的溶瘤病毒改造
阿诺医药2017年以8660万美元获得Oncolytics Biotech的Reolysin（pelareorep）在大中华区、新加坡和韩国的商业化许可。pelareorep是一种未经修饰的非致病性呼肠孤病毒，通过静脉注射给药。
2019年2月，pelareorep获得了NMPA颁发的临床试验批件，在中国开展联合紫杉醇治疗晚期/转移性乳腺癌的开放、随机、多中心Ⅲ期临床试验。
基于柯萨奇病毒的溶瘤病毒改造
乐普生物除了参股武汉滨会生物，还在2018年1月以2963万澳元参股澳洲Viralytics公司，将CAVATAK引入中国并开展临床试验。柯萨奇病毒CAVATAK（CVA21）可特异性结合癌细胞表面高度表达的蛋白质ICAM-1（intercellular adhesion molecule-1）。同年2月22日，乐普生物又将Viralytics转让给默沙东。
小结
溶瘤病毒对肿瘤的杀伤作用表明了其在肿瘤免疫中的独特优势，对其进行工程化改造或与PD-1/L1联用，放大其肿瘤免疫疗效，是现在溶瘤病毒开发的主要策略。