细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）既是农作物利用杂种优势、进行轮回选择和群体改良的重要工具，又是研究花粉发育、细胞质遗传和核质互作、环境因素对线粒体基因表达的调控以及物种进化的重要材料。因此，研究细胞质雄性不育分子机制与育性恢复机理不仅具有重要的理论价值，而且具有重要的生产应用价值。
近日，法国农业科学院（INRAE）Jean-Pierre Bourgin研究所王传德博士等在PNAS发表题为 The radish Ogura fertility restorer impedes translation elongation along its cognate CMS-causing mRNA 的研究论文，解析了油菜Ogura细胞质雄性不育的育性恢复分子机理。该研究发现，育性恢复PPR-B蛋白特异结合在不育基因orf138的编码区内，抑制了orf138 mRNA翻译延伸，从而降低Orf138蛋白含量以达到育性恢复的目的。
研究背景
植物细胞质雄性不育是一种核质互作抑制有效花粉产生的遗传性状，属母性遗传。大量的遗传学、细胞学和生物化学的研究，特别是细胞器分离技术和离体翻译体系的建立，以及植物基因组计划的推动，证明了线粒体DNA的变异与CMS有关，线粒体基因组的变异或特异的线粒体基因表达会导致雄性不育。恢复基因（Rf）存在于细胞核中，能够逆转CMS表型并恢复育性。目前已克隆出来的恢复基因编码的蛋白质大部分含有PPR（pentatricopeptide repeat）基序。PPR蛋白在细胞器基因表达的各个过程中都具有至关重要的作用，许多PPR蛋白通过与目标RNA的特异结合，对目标RNA进行剪切、加工和编辑。
Ogura不育源是在萝卜中发现的天然雄性不育类型，雄性败育彻底。鉴于其优良的不育特性，经过几代人的努力，Ogura CMS 已通过远缘杂交和原生质体融合成功转移到甘蓝型油菜中。目前Ogura CMS 是北美及欧洲等地主要应用于生产油菜杂交种的细胞质雄性不育类型。Ogura-CMS 属核质互作雄性不育类型，其育性由线粒体嵌合基因 orf138 和细胞核育性恢复基因 PPR-B (Rfo)控制。前期研究发现PPR-B蛋白不影响不育基因orf138转录模式，包括转录本丰度、大小及稳定性，故而推测PPR-B影响orf138 mRNA 的翻译或翻译后调控，但其确切的分子机制尚未明确。
研究结果
本文作者首先利用免疫印记，体外细胞器翻译及多聚核糖体沉降分析，表明PPR-B 对 orf138 mRNA 与多核糖体结合有负面影响并且PPR-B 介导的翻译抑制是 orf138 所特有的。随后作者采用了翻译组和转录组分析，用以比较不育系和恢复系中线粒体编码的 mRNA 的翻译状态。结果表明，在转录水平上，PPR-B 对线粒体的大部分mRNA 丰度没有重大影响；而翻译水平上，与 CMS 系相比，恢复系中orf138 mRNA翻译效率降低了16倍，而其它大多数线粒体mRNA翻译效率降低了不到2倍。以上结果说明了恢复系中缺乏 Orf138 蛋白是由于 orf138 mRNA 翻译被PPR-B严重抑制。前期研究表明 PPR-B 在体内与 orf138 mRNA 特异性结合。为了了解这种结合是如何对 orf138 翻译产生负调控，作者鉴定了 orf138 mRNA中 PPR-B 的结合位点。作者首先利用PPR蛋白识别代码（PPR code）来预测PPR-B蛋白的RNA结合区域，鉴定出一个位于orf138 起始密码子下游 55 个核苷酸的短片段的结合区域。进一步的RIP-seq分析，发现了一个包含67 个核苷酸区域在 PPR-B 免疫沉淀中高度且特异性地富集，并且该区域位于 orf138 编码序列内，包括所预测的 PPR-B 结合位点。随后的凝胶迁移实验表明，PPR-B蛋白与之前鉴定的RNA结合区域都显示出清晰而强烈的结合亲和力。总之，这些结果表明育性恢复PPR-B蛋白与orf138 mRNA 的编码序列特异性相结合。鉴于PPR-B 结合位点在 orf138 编码序列中，促使研究者详细分析了在PPR-B存在或不存在的情况下沿 orf138 mRNA的核糖体足迹分布。研究人员比较了恢复系和CMS系中PPR-B蛋白在orf138 结合位点前后转录本上核糖体覆盖的平均数量，发现相比结合位点之前，位于 PPR-B 结合位点下游的 orf138 片段的核糖体密度的短缺更为显著，并且与观察到的恢复系中 orf138 基因的翻译减少具有相同的幅度。这表明恢复蛋白PPR-B不影响orf138的翻译起始，而是PPR-B结合在orf138的编码序列内，并充当核糖体阻滞剂，阻碍沿orf138 mRNA的翻译延伸。
结果与意义
综上所述，本研究利用油菜Ogura 雄性不育及恢复系统，揭示了细胞核育性恢复基因PPR-B通过特异性抑制线粒体编码的不育基因orf138 mRNA翻译来恢复其雄性不育性状，同时还证明 PPR-B 结合orf138 的编码序列内，充当核糖体阻滞剂，特异阻止沿 orf138 mRNA 的翻译延伸。对 PPR-B 生化活性的分析揭示了一种新的翻译调控模式，暨细胞核编码的RNA结合蛋白抑制细胞器RNA翻译延伸。最近对 PPR 识别代码的破译允许重新编码 PPR 蛋白以结合任何感兴趣的RNA序列，因此本研究也为今后合成那些本身缺乏有效天然恢复基因的CMS系统的育性恢复蛋白奠定了基础。
图7. Ogura-CMS育性恢复的分子作用模型。
法国农业、食品与环境研究院（INRAE）Jean-Pierre Bourgin研究所王传德博士是本文的第一作者，Hakim Mireau研究员为通讯作者。该工作得到法国国家科研署基金，巴黎萨克雷大学植物科学中心等经费支持。
原文链接：
https://doi.org/10.1073/pnas.2105274118.
