复方龙星片对烟雾联合脂多糖诱导COPD大鼠的作用及机制研究

目的COPD是一种常见的、可以预防和治疗的疾病,其死亡率高,严重危害人类健康。复方龙星片为根据全国名老中医黄吉赓处方制备而来的曙光医院院内制剂,临床治疗COPD疗效显著,但其作用机制尚不明确。本研究对其机制进行了探讨。方法(1)将Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、龙星片低、中、高剂量组、阳性沙丁胺醇和地塞米松组,烟熏4周后开始给药干预直至处死,烟熏12周后气管滴注脂多糖溶液,烟熏16周后全部处死,检测肺功能,取肺组织HE、Masson染色观察气道病理及形态,ELISA测血清炎症因子IL-8、TNF-α、LTB4水平,生化法测氧化应激相关蛋白MDA、SOD、GSH/GSSG水平。(2)基于Illumina hiseq平台,对空白、模型、龙星片组大鼠肺组织在某个时期转录出来的所有m RNA进行测序,完成原始数据质控、转录组整体质量的评估后,分析表达量,对样本两两间比较,以FDR<0.05&|log2FC|≥1为标准,筛选显著差异表达基因,对其进行GO功能注释分类、富集分析、KEGG通路富集分析及剪切分析。(3)参考药效结果以“inflammatory response”、“oxygen”、“immune”、“Metabolic”为功能关键词,筛选模型和龙星片组间显著富集的功能基因,对其文献检索,依据检索结果,参考基因参与的生物过程、平均表达值、基因之间有无相互作用,预测可能的靶基因;对模型和龙星片组间差异基因按|log2FC|值降序排列顺序,依据文献检索结果,参考|log2FC|值、基因之间有无相互作用,预测可能的靶基因;合并二者基因运用RT-PCR、Western blot技术验证其表达,以确定龙星片防治COPD作用的靶基因。(4)借鉴计算机虚拟筛选方法的思路,从NPASS数据库筛选龙星片处方药材活性成分,在ETCM数据库检索其作用的预测靶基因,以已确定靶基因为导向,筛选可能药效成分,进而运用高效液相建立药效成分指纹图谱。结果(1)与空白组比较,模型组食量减少,可见剧烈的腹式呼吸,时可闻及咳嗽和哮鸣音;气管黏膜上皮气道上皮排列紊乱、黏膜皱增多变长、管壁增厚,气道周围有大量以淋巴细胞、浆细胞为主的炎症细胞浸润,平滑肌显著增生肥厚、气道壁胶原纤维增多;FEV0.2/FVC、PEF显著下降,FRC显著上升(P<0.01),平均内衬间隔、肺泡破坏指数明显增大,平均肺泡数明显降低(P<0.01);支气管壁总面积、管壁厚度明显升高,内周长明显降低(P<0.01);IL-8、TNF-α、LTB4、MDA含量明显升高(P<0.01,P<0.05),SOD活性、GSH/GSSG显著下降(P<0.01)。与模型组比较,复方龙星片各剂量组、沙丁胺醇组、地塞米松组,气管黏膜纤毛柱状上皮细胞较为完整,管壁增厚,管腔变小的情况均较轻、气道周围分布的炎症细胞较少、小气道胶原纤维均降低;FEV0.2/FVC、PEF值均显著升高(P<0.01),FRC值中、高剂量组升高(P<0.05);平均内衬间隔、肺泡破坏明显降低,平均肺泡数明显增大(P<0.01);支管壁厚度降低,而内周长增加(P<0.05),血清中IL-8、TNF-α、LTB4、MDA含量均有下降(P<0.01,P<0.05),SOD活性、GSH/GSSG明显升高;其中复方龙星片高剂量作用最强,地塞米松与沙丁胺醇组之间无显著性差异。(2)通过筛选分析,共检测到基因32662条,其中空白和模型组表达差异基因2484条,2034条得到注释,其中上调1532条,下调502条,涉BP、CC、MF,3大类。在BP分类中主要包括单有机体过程、细胞过程、生物调节、代谢过程、生物过程的调节等25个小类;在CC分类中主要包括细胞、细胞部分、细胞器、膜、膜部分等19个小类;在MF分类中主要包括结合、催化活性、受体活性、分子转导活性、转运蛋白活性等18个小类。GO功能富集结果显示,BP富集373项,主要参与纤毛运动、细胞杀伤的调节、细胞外基质组织、纤毛轴动力蛋白复合体等过程;CC富集62项,主要构成纤毛、血液微粒、免疫球蛋白复合物、细胞外区域、质膜的内在成分等组分;MF富集64项,主要实现抗原结合、碳水化合物结合、转运活动、趋化因子受体活性、氧结合等分子功能。KEGG通路分析显示分别参与环境信息处理,基因信息处理,细胞过程,机体系统,人类疾病,新陈代谢6大类KEGG通路,其中富集最为显著的为细胞因子-细胞因子受体相互作用、同种异体移植物排斥、非洲锥虫病、移植物抗宿主病、I型糖尿病、百日咳、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞粘附分子(CAMs)、自身免疫性甲状腺疾病、补体和凝血级联。模型和龙星片组间差异基因2082条,有1723条得到归类注释,其中上调253条,下调1470条,涉及BP、CC、MF,3大类。BP、MF分类与空白和模型组差异基因相同,而CC分类主要包括细胞部分、细胞器、膜、膜部分、大分子复合物等18个小类。GO功能富集结果显示,BP富集282项,参与的过程中更多体现在炎症反应、免疫反应、对细菌来源分子的反应、对脂多糖的反应、细胞对含氧化合物的反应等过程;CC富集57项,主要构成纤毛、血液微粒、免疫球蛋白复合物、细胞外区域、质膜的内在成分等组分,MF富集37项,主要实现抗原结合、碳水化合物结合、转运活动、趋化因子受体活性、抗氧化等分子功能。显著性富集的KEGG通路,排在前10的分别为细胞因子-细胞因子受体相互作用、补体和凝血级联、金黄色葡萄球菌感染、原发性免疫缺陷、非洲锥虫病、用于Ig A生成的肠道免疫网络、百日咳、疟疾、阿米巴病、氨基糖和核苷酸糖代谢。空白组、模型组、龙星片组大鼠肺组织可变剪切主要为TSS、TTS、SKIP、AE、IR,数量依次为21699、19050、5313、2410、1339;22092、19381、5143、2421、1377;21467、18785、5321、2491、1785。(3)筛选出可能的靶基因15个,经RT-PCR检测后,筛选出LBP、TIMP1、JAK3、NOXO1、ADAM8、SMAD6,6个基因进行Western blot验证,Western blot结果与RT-PCR及测序结果一致。(4)在NPASS数据库中共检索到36个黄芩活性成分,2个地龙活性成分,64个干姜活性成分,0个制南星活性成分;利用ETCM数据库预测活性成分靶基因,再通过药效靶基因逆向筛选,确定黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、野黄芩苷、千层纸素A、白杨素、芹菜素预测靶基因为JAK1(与JAK3同族),预测系数均大于0.85;建立了龙星片高效液相液相指纹图谱,并指认归属了黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、野黄芩苷、白杨素6个成分。结论(1)复方龙星片能够通过降低COPD模型大鼠炎症因子、氧化应激水平,改善肺功能,减轻肺组织、气道病理改变,从而达到治疗COPD的作用。(2)对龙星片干预后的大鼠肺组织进行转录组测序,完成表达差异基因GO功能、KEGG通路分析,可变剪切分析,富集功能包含炎症反应、氧化应激信号通路。模型组可变剪切类型主要为SKIP、TSS、TTS,而龙星片组主要为TSS、TTS、IR。(3)确定龙星片防治COPD作用的靶基因为LBP、TIMP1、JAK3、NOXO1、ADAM8、SMAD6,其中对ADAM8的抑制作用,在COPD研究中尚未见报道(4)黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、野黄芩苷、白杨素为龙星片的药效成分,JAK3为关键靶基因。...