Science：施一公团队首次报道激活状态人源次要剪接体结构​

前体mRNA的剪接是mRNA成熟过程中的重要一步【1-3】。剪接过程涉及基因中非编码内含子的去除和外显子编码区的连接，是通过形成剪接体（splicesome）实现的。一段内含子区域包含三段序列元素：5’端剪接位点（5’SS）、分支点序列（BPS）及3’端剪接位点（3’SS）。大多数内含子为U2型，由包含U2核内小RNA（snRNA）的主要剪接体（major splicesome）去除。近些年，随着单颗粒冷冻电镜技术的突破，一系列人源和酿酒酵母来源的剪接体复合物结构获得解析，目前已重建出剪接过程中各主要中间状态的近原子分辨率结构【4】（图1），极大丰富了学界对剪接过程的认识。

图1 前体mRNA剪接过程主要复合物结构【4】

此外，细胞内还存在一小部分U12型内含子。这类内含子最早发现的典型特征包括5’SS 5’端的AT和3’SS的AC二核苷酸【5】，且其5’SS和BPS区高度保守。U12型内含子的剪接由次要剪接体（minor splicesome）执行，主要包含5种snRNA：U11、U12、U4atac、U5及U6atac，其中仅U5同时存在于主要剪接体中。含有U12型内含子的基因广泛存在于各类真核生物（真菌、植物及动物）中，在发育中起基础作用，通常一个基因中仅包含一段该型内含子，但由于胞内次要内含子含量稀少，其剪接成为整个过程的限速步骤。

图2 两类内含子序列特征【6】

鉴于其在胞内极低的含量，次要剪接体的生化研究此前很难开展，迄今仍缺乏有效的分离纯化方法，更遑论对其结构细节的解析，甚至次要剪接体各状态的组成成分也不清楚。2021年1月28日，西湖大学施一公团队在Science杂志发表研究长文Structure of the activated human minor spliceosome，攻克了次要剪接体的分离难关并率先解析出激活状态下的次要剪接体Bact复合物的冷冻电镜结构，首次揭开次要剪接体的神秘面纱。

研究者首先利用早先报道的Hela细胞体外剪接体系【5】结合反义寡核酸链降解实验确认U12型前体mRNA剪接过程的发生。借鉴U2型前体mRNA构建策略，将其中内含子区的5′SS、BPS及3′SS替换成U12型序列，并截掉BPS下游用于结合ATP酶/解旋酶Prp2的18个核苷酸，以促进Bact状态次要剪接体复合物的积累；为方便纯化，还在5’SS和BPS间插入串联的3段MS2结合位点，最终成功纯化到次要剪接体Bact复合物；为增加复合物稳定性还进行了化学交联。

最终解析获得的次要剪接体Bact复合物结构的平均分辨率达到2.89Å，核心区分辨率2.6 Å。该结构的原子模型共包含45种蛋白，三种snRNA（U12、U5、U6atac）及构建的前体mRNA（图3），总分子量1.7M。结构中的RNA部分整体组织形式类似此前解析的主要剪接体Bact 复合物【7】，尤其是活性位点处的RNA结构呈现几乎完全相同的构象，但在部分细节上存在明显差异（图4）：如U12/U6atac双螺旋缺少Helix II，U6atac通过六对经典的Watson-Crick 配对及一对Hoogsteen配对识别U12型内含子5’SS区高度保守的5′-AUAUCCUUU-3′，U12中参与识别BPS区的碱基配对达到九对。此外，结构中具有催化功能的两个金属离子M1和M2均位于活性中心，利于催化Bact复合物中的分支反应。

图3 次要剪接体Bact复合物结构【8】

图4 次要（彩色）和主要（灰色）剪接体Bact复合物中RNA组分的结构比较【8】

更多的结构差别来自蛋白组分。相较于主要剪接体Bact复合物，次要剪接体中缺少包括5种NTC和NTR组分在内的共13种蛋白，但发现了5种新蛋白组分（图5），即参与组成U12 snRNP的SCNM1，三种剪接因子ARMC7、CRIPT、RBM48，及首次在Bact复合物中重构出的PPIL2，它们分别执行不同的重要功能。小鼠中的SCNM1负责调节离子通道病的严重程度，其在次要剪接体中的功能类似主要剪接体中的SF3a复合体：N端结构域作用类似主要剪接体中的SF3a66，包含一个C2H2型锌指结构，与BPS/U12螺旋存在相互作用，通过其N端三个保守残基参与稳定5’SS的识别并维持U6atac构象；C端结构域行使类似主要剪接体中SF3a60的功能，与SF3b130和SF3b145发生相互作用。CRIPT包含两个锌指结构域通过与其他蛋白相互作用稳定U12 snRNP的稳定。

图5 次要和主要剪接体Bact复合物差异组分比较（注：结构中灰色部分为两个结构共有的组分）【8】

PPIL2是人体细胞八种核内亲环素之一，从酵母到人高度保守。其序列N端包含一段U-box型的E3泛素连接酶结构域，C端包含一个脯氨酰肽基异构酶结构域。在本次重构的结构模型中，PPIL2共鉴定出4段间隔的片段，分别发挥不同的作用：片段I及N末端参与U5 snRNA的相互作用、稳定loop I构象、帮助5’外显子锚定；片段II中鉴定出两段E3泛素连接酶结构域，且两段的构象类似；片段III和IV呈延展构象，分别与NTC和NTR组分存在相互作用，参与稳定U5 snRNP的结构。

RBM48结构中包含一段RNA结合结构域，是U12型内含子剪接过程的必需组分，在结构中与ARMC7形成一个复合体，与U6atac/5′SS螺旋存在相互作用，结合U6atac的γ-单甲基磷酸帽子，并通过其关键氨基酸参与稳定U6atac 5’端未配对的碱基。

图6 人源次要和主要剪接体Bact复合物的结构差异【8】

有意思的是，尽管U12型内含子广泛存在于各类真核生物中，分布在涉及DNA复制、修复、转录、RNA加工和翻译、细胞骨架组织、膜泡运输、电压门控离子通道活性等相关功能基因中，但在典型模式生物酿酒酵母和秀丽线虫中则未检出。此外，有关次要剪接体的组成、功能状态、催化和调节、结构重塑、及其与ATP酶和解旋酶作用方式等诸多问题还存在大量未知和空白。此次人源激活状态次要剪接体结构的揭示，为相关科学问题的解答提供了初步的结构学证据，相信不久定将涌现出更多次要剪接体结构和功能的全新发现。

https://science.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.abg0879

参考文献

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3. D. Frendewey, W. Keller, Stepwise assembly of a pre-mRNA splicing complex requires U-snRNPs and specific intron sequences.Cell42, 355–367 (1985).

4. R. Wan, R. Bai, X. Zhan, Y. Shi, How Is Precursor Messenger RNA Spliced by the Spliceosome?Annu. Rev. Biochem.89, 333–358 (2020).

5. W. Y. Tarn, J. A. Steitz, A novel spliceosome containing U11, U12, and U5 snRNPs excises a minor class (AT-AC) intron in vitro.Cell84, 801–811 (1996).

6. B. Verma, M. V. Akinyi, A. J. Norppa, M. J. Frilander, Minor spliceosome and disease.Semin. Cell Dev. Biol.79, 103–112 (2018).

7. D. Haselbach, I. Komarov, D. E. Agafonov, K. Hartmuth, B. Graf, O. Dybkov, H. Urlaub, B. Kastner, R. Lührmann, H. Stark, Structure and Conformational Dynamics of the Human Spliceosomal Bact Complex.Cell172, 454–464.e11 (2018).

8. R. Bai, R. Wan, L. Wang, K. Xu, Q. Zhang, J. Lei, Y. Shi, Structure of the activated human minor spliceosome.Science, Doi: 10.1126/science.abg0879 (2021).