综述 | Curr. Opin. Microbiol.:人类肠道菌群中抗生素抗性基因的水平转移
编译：红皇后，编辑：小菌菌、江舜尧。
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由抗生素抗性细菌引起的感染是公众健康的重要威胁，导致这些感染的致病菌会通过被称为水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）的过程中获得抗生素抗性基因 (AntibioticResistance Genes, ARGs)。HGT是人类肠道微生物生态系统中的很常见过程，其具有多种不同的分子机制，其中转导和接合转移是被研究的最清楚的HGT机制。新开发出的生物信息学工具和实验方法可以确定ARGs与其微生物宿主的关联并量化肠道菌群中HGT的发生频率。对肠道菌群中HGT的研究有助于开发新的干预措施，从而最大程度地减少ARGs在共生微生物和机会致病菌之间的传播。
论文ID
原名：Horizontal transfer of antibiotic resistance genes in the human gut microbiome
译名：人类肠道菌群中抗生素抗性基因的水平转移
期刊：Current Opinion in Microbiology
IF：6.916
发表时间：2020.03
通讯作者：LisaE Lamberte and Willem van Schaik
作者单位：伯明翰大学
主要内容
1 人类肠道菌群和抗菌素耐药性
人类肠道菌群这一描述，包含了人类肠道中的微生物、这些微生物的基因组以及肠道的环境条件。在过去的十年中，高通量、低成本测序方法的大量应用推动了肠道菌群的研究，这些研究的主要目的是揭示人类肠道菌群的组成、功能及其在疾病中的作用。人类肠道包含数百种细菌物种，统称为肠道菌群，其中属于拟杆菌门和厚壁菌门的细菌占健康成年人肠道中所有细菌的90％，而通常情况下，放线菌门、变形菌门和疣微菌门的丰度较少，但是这些微生物主要发挥抵抗致病菌入侵的重要功能。大多数肠道细菌与人类宿主之间具有协同或共生的关系，但肠道菌群中也会含有机会致病菌，例如属于肠道菌科的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌以及属于肠球菌科的粪肠球菌和屎肠球菌。人类肠道中的机会致病菌会使宿主个体发生尿路感染，而对于免疫功能低下的人类，还会引起更加严重的系统性感染。近几十年来，由具有抗生素抗性的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌引起的感染在全球范围内呈上升趋势。
由抗生素抗性细菌引起的感染是对全球公共卫生的重大威胁。仅在欧盟，每年由于抗生素耐药性感染而导致的死亡就要超过30000例，其中意大利和希腊由于抗生素抗性细菌感染导致的死亡最为严重。在亚洲、非洲和南美洲的低收入和中等收入国家，由多重耐药性感染引起的疾病发病率和死亡率甚至更高还要高于欧洲。
细菌对抗生素产生抗性的主要机制为：降低细胞内抗生素的浓度，修饰抗生素靶标，修饰或降解抗生素本身。细菌获得这些抗性机制可以通过染色体基因突变和HGT的过程中从其他菌株中获得ARGs。通过HGT进行基因转移在ARGs的全球传播中发挥了重要的作用，HGT可以在任何环境中发生，尤其是当细菌负荷很高时，例如在土壤、污水处理厂以及人和动物的肠道菌群中。
当大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌和其他机会致病菌在人的肠道中定植时，它们就有可能从肠道菌群的其他成员那里获得ARGs。先前的研究表明，肠道具有许多不同的ARGs，这些ARGs被统称为“肠道抗性组”。在这篇综述中，作者概述了人类肠道菌群中HGT的不同机制，以及研究该微生物生态系统中HGT的创新方法。
2 水平基因转移机制
ARGs可以通过多种机制水平转移，其中最重要的是转化、转导和接合转移（图1）。
图1 水平基因转移的机制
在转化过程中，来自细胞外环境的裸露DNA被细菌吸收并插入其基因组，转化过程要求细菌是天然可转化的或感受态的。实验证明，超过80种细菌具有天然的感受态，同时许多其他物种中也检出了与DNA摄入功能相关的基因，表明转化的能力在细菌中可能非常普遍。我们对于在自然可转化细菌中导致感受态的刺激还所致甚少，但是营养缺乏和感受态诱导多肽的存在已经被确定为感受态的触发因素。重要的致病菌，包括淋病奈瑟氏球菌、霍乱弧菌和肺炎链球菌，都是天然具有感受态能力的致病菌，并且有研究表明这些致病菌会通过转化过程获得了抗生素耐药性。虽然肠道中的DNA酶的活性会降解大多数细胞外的DNA，但依然可以从喂食质粒的大鼠的肠道内容物中分离出完整的质粒DNA，这一现象表明，在肠道环境中天然感受态细菌可能吸收细胞外DNA。研究发现，大肠杆菌可以在自然条件下通过转化机制摄入质粒DNA，这表明大肠杆菌可以吸收肠道中的DNA，因此可以想象，转化可能有助于ARGs的传播。但是，目前尚不清楚DNA的转化过程中在肠道中发生的频率及其在肠道系统ARGs传播中的贡献程度。
膜囊泡（Membrane Vesicles,MVs）是20-250nm的球形结构细胞单元，主要由革兰氏阴性细菌产生，MV通过与目标细胞融合，从而将不同的物质在细菌细胞之间传递。肠道共生拟杆菌产生的MV中含有β-内酰胺酶，因而这些囊泡能够保护手提细胞免受β-内酰胺类抗生素的侵害。肠道细菌产生的MV也可能含有细胞质成分，包括DNA，含有DNA的MV被认为是由细胞外膜和内膜的突出而形成的，这导致了细胞质成分进入囊泡。研究发现，从不动杆菌属细菌中分离出的MV可以在体外转移抗生素抗性质粒，也有报道发现大肠杆菌的囊泡介导的DNA转移。虽然肠道内产生MV，并可能影响宿主的免疫反应，但尚不清楚它们是否也可以促进肠道菌群中的HGT。
转导过程是由噬菌体接到的细菌之间DNA的转移过程。处于溶菌周期中的噬菌体在衣壳合成过程中可能会掺入细菌宿主的DNA片段，紧邻溶源性噬菌体整合位点的DNA区域也可能会被切除并包装到衣壳中，此外，原噬菌体在宿主内部启动DNA复制过程时也有可能渗入宿主的DNA。这些噬菌体在从宿主细胞内释放之前，会大量复制，一旦被释放，宿主的DNA就可能会被包装到新的噬菌体颗粒中，并转移到其他细菌菌株中。人体肠道包含大量携带ARGs的噬菌体，并且在抗生素治疗后，人类肠道中这些携带ARG的噬菌体的丰度还会增加。一项基于小鼠模型的实验表明，转导是肠道定殖的大肠杆菌菌株遗传多样性变化的内在驱动力，并且可以促进肠道细菌中耐药性的出现。但是，与转化机制一样，目前尚不清楚D转导过程中在肠道中发生的频率及其在肠道系统ARGs传播中的贡献程度。
在接合转移过程中，可移动的遗传元件（例如质粒）以及整合或接合元件可以从一种细菌转移到另一种细菌。在这些接合元件中，可以说具有接合能力的质粒与ARGs的传播关联最为密切，因为它们具有携带多个抗性基因的潜力，并且其具有一种或多种毒素-抗毒素模块，能够确保质粒在其微生物宿主内能够稳定存在。此外，接合质粒还会携带ARG以外的其它基因，这些基因有助于微生物的适应性，例如编码新的代谢途径或对消毒剂或重金属的耐受性等，当ARG与这些基因处于同一个质粒上时，对这些基因的选择也会同时造成对ARG的选择。接合转移是一个复杂、多阶段且依赖于细菌细胞接触的过程，在此过程中，DNA通过菌毛在彼此紧邻的细菌之间转运。肠道具有高密度的细菌细胞和致密的粘液层，提供了有利于接合转移发生的环境。已有研究发现了抗生素抗性质粒和接合元件能够在人类肠道内的共生菌和机会致病菌之间转移。
2 研究肠道环境水平基因转移的生物信息学工具
鸟枪宏基因组技术使用高通量测序直接分析微生物生态系统中的DNA，目前已经被广泛用于研究人类肠道菌群的微生物多样性，其中Illumina公司的DNA测序平台使用最为频繁。由Illumina测序仪产生的相对较短的序列可用于检测人类肠道菌群中的ARGs并计算其丰度。但是，确定ARGs和MGEs的位置关系依然具有很高的挑战性，因为这些遗传单元通常富含DNA重复序列，很难通过序列进行组装。纳米孔和PacBio测序等长读长技术的出现允许从复杂的宏基因组学样本中重建基因组和质粒序列。无论使用哪种测序平台，基于DNA测序的方法一直难以鉴定ARG的微生物宿主并检测HGT事件，近期，研究人员开发出了一些先进的生物信息学工具来尝试解决这一问题。
目前已经开发出了多种鉴定宏基因组测序数据中的HGT事件的方法。MetaCHIP使用最佳匹配和系统发育方法相结合，根据已组装到的contig或基因组中具有不同分类学分配的基因来识别可能的HGT事件。MetaCherchant，使用局部de Bruijn图组装的方法探索更大范围内ARG的相邻基因。当比较一个时间序列的宏基因组数据时，基因含量的变化表明可能发生了HGT事件。最近开发的一种基于纳米孔或PacBio测序技术中DNA甲基化模式的分箱技术已被证明可用于分析MGEs的宿主微生物分类学，测得序列中的甲基化模体被赋予一个分数，来自MGE和细菌基因组的DNA序列可以基于它们的甲基化分数进行匹配，从而确定MGE的宿主，如果同一个MGE匹配到了多个宿主，则表明可能发生了HGT事件。但是，单独的宏基因组学方法仍无法准确识别所有HGT事件，因为仅通过DNA测序无法有效识别携带ARG的治理在不同微生物宿主之间的接合转移，因此，研究人员开发出了一些基于实验的方法来分析肠道菌群中的HGT事件（图2）。
图2 分析肠道中水平基因转移的实验方法
人类肠道中HGT的研究从20世纪60年代就开始了，在这些研究中，科研人员将能够转移DNA的供体菌和受体菌株一同添加到宿主体内，之后使用选择行培养基从宿主的粪便中分离出转化接合子，但是这些研究因为存在使多药物耐药性工体或转化接合子定植在志愿者肠道中的风险，因而在伦理学上具有很大的实施困难，目前更多关于肠道菌群HGT的研究是基于动物模型（图2a）。目前，使用选择性培养基已经从人类粪便中鉴定到了多种ARGs的新型宿主，例如在肠道共生的Eggerthella lenta和无毒梭状芽胞杆菌中发现了携带vanB的万古霉素抗性转座子，其可以在消暑肠道中转移到机会致病菌粪肠球菌中，这些发现支持了肠道共生菌群是ARGs储存库的假设。虽然在分离肠道菌群领域人类已经取得了更高的成就，但是依然有许多肠道微生物无法被培养，而使用上述技术的前提就是受体微生物需要能够进行纯培养，因此目前还无法全面的、系统的鉴定人类肠道中哪些微生物可以获得ARGs。
近年来，出现了一种允许对微生物群落中的HGT事件进行高通量表征的新技术，使用含有荧光标记的质粒进行研究，能够通过共焦荧光显微镜和荧光活性细胞分选（FACS）等技术揭示质粒的宿主范围（图2b）。在一项研究中，通过使用带有绿色荧光蛋白基因（gfp）的质粒来鉴定HGT事件，该基因的表达受染色体编码的阻遏物控制，在质粒进入到新的宿主细胞内后，gfp的抑制被解除，之后使用FACS根据绿色荧光分离转化接合子，最后通过16S rRNA基因测序鉴定质粒已扩散至哪些宿主微生物。这种方法的缺点是一次只能检查一个质粒，这限制了我们对微生物组中HGT事件更广泛的认识。此外，除大肠杆菌MG1655等模型菌株外，在微生物宿主中进行这些研究的遗传工具还非常有限。
目前，还存在几种技术可以在微生物群落水平获得ARGs与其微生物宿主的物理连接信息，这些数据可用于阐明微生物群落中ARG的传播方式（图2c）。在epicPCR技术中，单个微生物细胞被封装在聚丙烯酰胺磁珠中，然后在单个磁珠中进行融合PCR步骤，这能够获得靶向基因（例如ARG）和16S rRNA基因的关联信息，这一信息可以作为系统发育标记。可以使用Illumina技术对所得的融合PCR扩增子进行测序，以鉴定epicPCR中靶向基因的宿主，epicPCR技术已被用于确定废水中ARG宿主的多样性。
另一项可以用来识别ARGs细菌宿主的技术是染色体结构捕获，也叫做3C。在3C的实验过程中，会将细胞与甲醛一起孵育以使DNA发生交联，然后通过限制性酶切消化、交联的DNA的链接和逆转交联的过程得到3C文库，对生成的3C文库进行测序，可以揭示带有ARG的MGE与染色体DNA的交联，从而确定MGE的宿主。在小鼠肠道菌群样品上进行了宏基因组3C（meta3C）技术已经成功的识别了噬菌体序列的细菌宿主。此外，一种称为Hi-C的3C衍生技术也已被用于将ARGs连接到各种复杂样品中的细菌宿主上，有研究人员通过对废水样品进行Hi-C测序，评估了ARGs的微生物宿主和质粒的原位宿主范围，发现拟杆菌门是该样品中最常见的ARGs宿主。同样使用Hi-C数据，结合长读长序列的组装，科研人员确定了牛瘤胃微生物组中病毒和ARG的微生物宿主。Hi-C技术通常在人类肠道菌群样品中被使用，在一项开创性研究中，大约600kbp的大质粒被定位存在于梭菌目中。然而到目前为止，虽然3C及其衍生技术在鉴定人类肠道菌群中ARG的宿主上使用的还不是非常广泛，但已有的研究为使用这些新技术研究肠道HGT提供了基础。
最近的一项基于CRISPR-Cas9系统的研究描述了使用该系统分析HGT事件的可能性（图2d）。 CRISPR-Cas9是一种适应性免疫系统，细菌使用该系统防御外来DNA的入侵。 Cas1-Cas2复合物以一种称为间隔子获取的过程将入侵的DNA掺入到CRISPR基因座的细菌基因组中，这些序列随后被转录并被用作Cas9核酸酶的靶标。为了分析HGT事件，Munck等人在诱导型启动子的控制下设计了一种含有cas1-cas2操纵子的质粒的大肠杆菌菌株，以捕获进入细胞的DNA序列，然后使用CRISPR间隔区的测序不仅鉴定了HGT事件，而且还确定了HGT事件发生的顺序，这项技术有望以前所未有的分辨率揭示HGT事件。
3 结论和未来展望
人的肠道菌群中包含各种各样的ARGs，基于现代测序技术和实验技术的研究揭示了抗性基因在肠道菌株和菌种之间传播的程度。那些具有临床相关抗生素抗性的基因及其通过MGEs在致病菌中的传播是对临床感染治疗的直接威胁，尽管噬菌体可以再染色体基因之间移动，但质粒的接合转移仍被广泛认为是耐药基因可以在细菌之间转移的最重要方式。
革兰氏阳性共生细菌的基因组中也发现了机会性致病菌中一致的ARGs，这表明肠道中ARGs的HGT普遍存在，特别是在厚壁菌门中。碳青霉烯酶和广谱β-内酰胺酶在机会性致病菌，例如大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中的流行程度越来越高，并且这些基因可以很容易地在肠道内传播到变形菌门中，但是到目前为止，还没有跨微生物门进行HGT的证据。不同门微生物中抗性基因HGT发生频率很低可能是由于不同门微生物的所需要特定的生理环境差别很大，这使得抗性基因不可能以较低的生物学成本在系统发育完全不同的细菌中发挥功能。然而，土壤微宇宙实验的结果表明质粒可以在不同的菌群门之间传播，尽管这种情况很少发生。作为肠道菌群中常见的事件，携带抗性基因的广宿主MGE的HGT不太可能是从不同门细菌间的传播开始。目前依然缺乏关于肠道菌群中有利于HGT事件发生的条件的相关知识，但已经发现宿主的炎症反应或者由肠道菌群或宿主合成的细胞膜破坏物质会促进肠道中的HGT。
对肠道中HGT的进一步了解为开发新的技术方法以最大程度地减少ARG的转移提供了有效的支持，例如，通过CRISPR-Cas选择性地消灭携带抗性基因的菌株。作者设想，本文所概述的新技术将有助于进一步阐明人类肠道中ARG的转移网络，从这些研究中收集到的信息可为控制或减少人肠道中抗药性细菌数量的靶向方法的开发提供支持，这对那些具有高感染风险的人，例如新生儿、免疫功能低下的人和老人非常重要。
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