综述 | 微生物群和呼吸道（第一部分，推荐阅读）
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自细菌理论开始，我们就知道肺部不断暴露于吸入空气和上呼吸道的微生物群。最近，使用非培养的微生物鉴定技术已经证实，健康和疾病的肺都含有不同的微生物生态群体。这种揭示对呼吸健康以及传染性和非传染性肺病长期以来的发病机制的许多假设提出了挑战。认识到呼吸道是一个动态生态系统，为肺微生物学领域注入了新的假说,以及疾病发病机制的新概念模型。
肺微生物学的这场革命促使人们对定义的要求越来越明确和严格。“微生物组”一词在2001年由Joshua Lederberg首先提出，他用它来指“共栖的，共生的，和致病微生物的生态共同体，它们真正地共享我们的身体空间”. 微生物组作为一系列（例如“宏基因组”，“蛋白质组”，“代谢组学”）之一，最初仅指宿主体表和体内的微生物群。不幸的是，这个词与用于描述一个地点的“微观的生物群落”的生态学术语拼写相同：the micro-biome versus Lederberg’s microbe。对于本文，我们使用术语“microbiota”来表示从一个部位收集微生物。微生物组，我们指的是占据一个部位并受到该部位环境压力影响的微观细胞，病毒和噬菌体组成的群落。微生物组包括微生物和宿主细胞，以及调节这些细胞相互作用的生物和非生物因子。人们对病毒、噬菌体和真菌对肺微生物组的贡献知之甚少；因此，我们的讨论主要局限于细菌。
原名：The Microbiome and the Respiratory Tract
译名：呼吸道的微生物群（微生物群和呼吸道）
期刊：Annual Review of Physiology
IF：15.754
发表时间：2016年
通信作者：Robert P Dickson
通信作者单位：Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan
1 这一领域的历史和发展
虽然“正常肺无细菌”这一概念在教科书中仍然很常见，但它几乎总是在没有引用或论证的情况下陈述。事实上，超过30篇已发表的研究使用现代分子细菌鉴定技术检测健康受试者的下呼吸道，没有任何证据表明下呼吸道不存在细菌。
1.1肺无菌这个概念的起源
在所谓的肺无菌论被公认之前，这是一个讨论活跃的话题。Louis Paster反驳肺无菌的证据是空气中存在活的微生物，而健康成人每天要吸入7000多升空气。一个世纪以前，传统观点并不是“正常的肺不含细菌”，而是不断暴露于吸入空气和上呼吸道的微生物中。
在随后的几十年中，几个概念性错误导致了普遍的、没有证据的主张-所谓“健康的肺没有细菌”。
第一个概念错误是临床微生物学检验的误用和错误解读。应用于呼吸道标本的最常用的细菌鉴定试验是临床微生物实验室的基于培养的方案。这些方案是为确定呼吸道病原体和区分急性感染的特殊目的而开发和优化的；他们没有开发出详尽的识别非感染性气道中存在的微生物群。这些检验选择性地不利于厌氧菌，和最佳生长温度低于37℃的细菌，其覆盖了许多现在描述为健康的肺微生物群。
第二个关键的概念错误是生态接触与污染混淆。肺部与上呼吸道粘膜直接相通，它们是微生物移入的主要来源；因此，它们的微生物群存在相当多的重叠是不足为奇的。然而，通常并假设肺标本中的细菌鉴定必须反映来自上呼吸道的污染。
第三个也是最重要的是：肺无菌的最终概念性错误是两个不同概念的混淆：无菌和不存在常驻微生物。肺部是微生物不断移动的低水平移民的宿主。肺无菌的概念源自假定在肺部繁殖微生物的居民缺失。然而，即使在缺乏其成员繁殖的情况下，一个微生物（或非微生物）群体可以完全由移民迁入和迁出的平衡来定义。
1.2 不依赖于培养的微生物鉴定技术的革命
在二十一世纪的第一个十年中，非培养的微生物鉴定技术的出现引起了对人类微生物组兴趣的激增。第一个将该技术应用于呼吸道标本的是囊性纤维化（CF）患者，这些早期研究表明痰标本中的细菌种类繁多，未被传统培养技术检测到。2010年，Hilty等人发表了在健康受试者气道中的首次应用，他们在健康志愿者和哮喘患者中使用支气管肺泡灌洗和保护性毛刷，并进行了两项关键的随后被验证的研究：a）健康呼吸道含有与上呼吸道相似但不同的细菌，b）呼吸道疾病患者的气道菌群有所不同，更富含变形菌门的菌群。几年之内，发表了各种肺部疾病的肺微生物群变化的报道。
2 用于肺微生物研究的技术
我们在这里回顾了非培养的微生物分析的基本原则，并讨论了呼吸道标本研究特有的挑战。
2.1 与培养无关的微生物鉴定方法
研究细菌群落最常用的现代方法是对16S rRNA基因的扩增子进行高通量测序。当使用平台如454焦磷酸测序和Illumina MiSeq进行测序时，从单个样本中分离出的DNA产生数千个短的基因组序列。这些序列根据公开可用的分类学数据库进行排列，排序和分类。序列按照相似性聚类；按照惯例，共有97％同源性的序列被归类为操作分类单元（OTU）。可以在整个标本中进行细菌总数丰度（使用定量PCR）的比较，相对丰度（一个标本的群体中有多少由一个单一的分类群组成）以及群落特征（如多样性）。这些基于测序的技术不依赖于传统培养技术苛刻的生长条件下的微生物繁殖，而这些技术未能鉴定出大多数与人类相关的微生物。
2.2 在肺微生物组研究中潜在污染源的影响
尽管以上总结的测序技术和生物信息学分析在微生物组研究中是常见的，而不管身体部位如何，呼吸标本的研究提出了独特的技术挑战。由于粪便等标本的细菌负荷高，因此程序性采样或实验室试剂引起的任何潜在污染都不需考虑，当人们研究相对较低生物量的呼吸道标本时，必须对实验的设计和解释给予额外的考虑。
试剂：由于健康肺中的细菌含量低，该领域的一个关键问题是实验室试剂中存在细菌DNA的潜在污染。无菌实验室试剂（包括DNA分离试剂盒中的那些）含有少量细菌DNA。这些发现强调了在肺微生物组分析中对程序控制标本进行深思熟虑的必要性。我们建议将多个突出的潜在污染源标本（如支气管镜清洗液，DNA分离缓冲液）与呼吸道标本同时测序。
上呼吸道：迄今为止，该领域的大多数研究都使用BAL液或保护性毛刷获得下呼吸道的微生物群。理论上，支气管镜通过上呼吸道有被咽部微生物群污染的风险，但多种证据表明这种影响很小。尽管嘴和鼻子的微生物群有显著差异，支气管镜插入的（口腔与鼻腔）的路径BAL微生物群没有可检测到的影响（图1）。
图 1
注：上呼吸道菌群对BAL菌群的影响缺乏。虽然口腔和鼻子的微生物群落差异很大(a)，但支气管镜插入(通过口或鼻)的路径对BAL微生物组(b)没有明显的影响。
痰标本已广泛用于某些疾病（如嚢性肺纤维化，支气管扩张和慢性阻塞性肺病）的研究。虽然使用痰标本有上呼吸道污染的风险，但在痰中所发现的微生物群的特征显著与许多生物学和临床意义的指标一致。因此，口咽微生物群的存在不会掩盖与确定的肺健康指数相关的痰中有意义的微生物信号。
3 人类呼吸道的生态学和局部解剖学
要了解一个生态系统-呼吸道生物群系是一个生态系统-必须考虑其地形条件和菌群动态。在肺微生物组的研究中，我们对这些因素的理解从一个世纪以来人类呼吸道解剖学，生理学和病理生理学的研究中获取。
3.1 呼吸生态系统的地形
从喉开始直至最远端的肺泡，没有任何屏障阻挡咽部的大量微生物。不同于肠上皮厚厚的保护性粘液层，在健康个体中，气道所产生的粘液较少（每天约100毫升）。在肺泡的表面有一层薄薄的富含脂质有选择性抑菌作用的表面活性物质覆盖，防止肺泡萎陷。因此，与富含营养的胃肠道环境相比，呼吸道一般是低营养的微生物环境。
3.2 呼吸道中的微生物群动态
肺部细菌的总负荷量和菌落成员数量取决于三个因素的平衡：微生物迁入、微生物消除和内部成员的相对繁殖率(图2a)。任何肺部微生物菌群的改变都必须归因于这三个因素的结合。在健康个体，肺微生物组很大程度上是由迁入微生物和消除微生物的平衡决定的，其成员的不同的繁殖率的影响相对较小。
图 2
注：呼吸微生物群落的生态模型。(a)呼吸微生物组的组成由三个因素决定:微生物迁移、微生物消除和其成员的相对繁殖率。在健康个体，菌群成员主要由迁入和消除决定；在晚期肺部疾病中，成员主要由区域生长条件决定。(b)改进的肺生物地理学的岛屿模型。呼吸道的某一特定部位菌群组成，是迁入和消除共同作用的结果。
微生物进入肺部的主要途径是微吸入，吸入空气，沿粘膜表面直接扩散。自1920年以来多项研究表明，亚临床微吸入在健康个体中普遍存在。此外，即使在穿过微生物密集的上呼吸道之前，大气中每立方米含有104-106个细菌。最后，繁殖的微生物菌落的直接连续扩散是微生物迁入的理论途径，但迄今为止还没有研究通过连续性毛刷来比较连续气道群落的组成。
肺部微生物消除是一个积极而持续的过程。健康的呼吸道采用粘膜纤毛滚梯（mucociliary escalator），利用纤毛上皮细胞沿着薄薄的，基底层分泌的粘液层不断的、稳定的推动微生物。即使在没有感染的情况下，健康个体每隔一小时大约咳嗽一次，推动微生物进入喉咽，在那里它们被吞咽或吐出。剧烈的咳嗽动作可能使呼吸道内的物质均匀化，这可能部分解释了健康人肺微生物群中观察到的相对较低的空间变化。最后，肺和呼吸道拥有多种先天和适应性免疫防御系统，可选择性识别，杀死和清除微生物群。宿主炎性细胞的丰度和特性与健康的肺微生物组的特征有关。
与呼吸道内微生物生长有关的局部条件是不均匀的。在影响细菌生长的许多环境因素中，在单一健康肺中可发现相当大的区域差异：氧分压，pH值，相对血液灌注，相对肺泡通气量，温度，上皮细胞结构，吸入颗粒的沉积以及炎症细胞的浓度和行为。但健康受试者肺内的空间变化是适度的，证实在健康个体中，肺部细菌生长的局部选择性压力没有微生物群落组成的微生物迁入和消除的平衡更来的重要。
借鉴生态学领域的开创性概念模型，提出了改进的肺部生物地理岛屿模型（图2b）。该模型提出，在健康肺中，呼吸道是从鼻孔延伸到肺泡的单一生态系统，包括连续的且持续不断变化的微生物地形，其受到来自单一来源群落（上呼吸道）微生物的不断迁入。呼吸树中某一特定地点的微生物种类数量是许多微生物迁入和消除的综合作用。
3.3 急慢性肺病对呼吸生态系统的影响
肺部疾病的存在改变了微生物迁入和消除的群体动态以及呼吸生态系统的地形和局部生长条件。每种肺部疾病一系列独特的解剖和生理变化，转化为一系列独特的环境条件，并改变了微生物群落（图3）。
图3
注：肺微生物群落因疾病状态而异。每个数据点代表从被标记的人群中获得的样本中检测到的细菌群落。每一种肺部疾病的独特的解剖和生理变化，转化为独特的环境条件和改变的微生物群落。“所有健康的肺都是一样的；每一个不健康的肺都是不健康的。
胃食管功能障碍和反流的出现加速了微生物群的迁入，这在严重的肺部疾病患者非常常见（> 70％的患病率）。许多疾病（例如，CF，支气管扩张和慢性支气管炎）具有粘膜纤毛清除障碍，这抑制了微生物清除速率。急性或慢性咳嗽以及宿主炎性细胞的涌入和激活，加速了微生物的消除。在肺气肿和肺纤维化等进展性破坏性肺疾病中，肺部的表面积减少了90％。因此，即使细菌的迁移率没有改变，相同的微生物数量也会分配到一个更小的地区；这可能部分解释了在严重破坏性肺病患者中观察到的细菌负荷增加。
急性和慢性肺病的存在显著改变了呼吸道微生物生长的局部条件。随着肺部疾病严重程度的恶化，肺微生物组的组成将更多地由局部生长条件和其成员的不同繁殖速度决定，而不是由微生物迁入和消除的平衡决定（图2a）。这种转变是有证据的，即长期以来公认的肺疾病严重程度与通过基于培养的检测出持续细菌种类（定居者）之间的关系：这些细菌代表群落中成员可以很好的适应受损的呼吸道的特定环境条件。呼吸道的损伤和炎症与粘液产生增加有关。粘液产生导致局部缺氧和温度升高，两者都有选择性地支持某些菌落的生长。气道和肺泡的炎性细胞大量生长和活化，杀死和清除具有高度可变性的细菌并在整个细菌群体中产生选择压力。宿主炎症反应的许多副产物，包括儿茶酚胺，炎性细胞因子，升高的温度，和游离的ATP都是已知选择细菌种类的生长因子。由于存在粘液和血管通透性，气道的营养供应突然增加，而在健康个体中匮乏营养物质。除了疾病中呼吸系统生态系统的内在变化之外，针对肺疾病的许多治疗对微生物生长条件也有明确的影响。补充氧气，全身和吸入皮质类固醇以及全身和吸入的抗生素可能对肺微生物群的流入，流出和相对繁殖率具有多种影响。
未完，明天见第二部分