玩转NGS实验室 | 第五期：NGS实验室分区介绍（中）：文库构建
高通量测序 (Next Generation Sequencing，NGS) 技术因其通量、成本和效率等各方面的优势，在肿瘤、遗传病及病原微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。随着相关临床研究的持续深入，政策法规的引导与完善，进一步推动了该技术在院内本地化的应用。“玩转NGS实验室”专栏旨在从多角度探讨NGS技术院内本地化应用的相关规范、应用项目及重要进展，推动NGS技术的临床转化。
高通量测序实验室建设按其功能可大致分为三部分：样本准备、文库构建、测序分析。各部分又因其主要工作内容可进一步拆分为不同分区，可进行单独管理。其后，我们将针对不同环节的具体分区情况、区域功能、注意事项、配套设备等展开详细介绍。
文库构建区域主要包括：试剂文库制备区、两个扩增及杂交区及两个纯化区，本区域功能是为后续测序环节提供完整合格的测序文库。
01
文库制备区
本区域为半污染区，区域功能：用于文库构建。包括样本的片段化、cDNA的合成、样品的纯化、核酸浓度检测、末端修复、接头连接等。
注意事项：
a. NGS检测时常见的文库制备方法有杂交捕获法和扩增子法，两种方法均包含通过PCR放大文库产量的步骤，因此在文库制备区构建文库后，建议文库产物传递至下一阶段区域（杂交捕获区）进行后续操作。[1]
b. 组织样本进行捕获法建库时需要先对样本做片段化处理，因此操作台面规划时应区分片段化区域和建库区域。[1]
仪器设备：医用冷藏冷冻箱、超净工作台、普通PCR仪、核酸定量仪、磁力架、超声打断仪、移液器、恒温金属浴、可移动紫外灯、涡旋振荡器、片段大小生物分析仪和掌上离心机。[2]
消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和移液器吸头（带滤芯），专用办公消耗品。
02
杂交捕获区（第一扩增区）
本区域为核酸污染区，区域功能：用于文库构建后的扩增，文库的pooling或捕获富集等。[2]
注意事项：
a. 避免PCR反应时的爆管和PCR反应后开盖，一旦发生要做好记录并及时做好核酸污染的清洁处理，并监测空气中是否已经存在气溶胶。[3]
b. 严防此区域扩增产物及气溶胶等对其它区域的污染，尽量减少人员在该区域与其它区域之间反复频繁流动，同时该区域的实验物品、实验服等尽量避免外带。[4]
仪器设备：医用冷藏冷冻箱、普通PCR仪、核酸定量仪、超净工作台、磁力架、恒温金属浴、真空浓缩仪、杂交仪、移液器、可移动紫外灯、涡旋混匀仪和掌上离心机。[2]
消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和移液器吸头（带滤芯），专用办公消耗品。
03
纯化区域
本区域为核酸污染区，区域功能：用于第1/2次PCR产物纯化，杂交捕获样本的纯化，对上机测序前的文库进行质控，并且完成文库上机前文库最终的稀释和混样。[4-5]
注意事项：该区域存在PCR扩增后产物开盖的操作，是核酸气溶胶重要来源的区域。[4]
仪器设备：核酸定量仪、磁力架、掌上离心机。
消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和移液器吸头（带滤芯），专用办公消耗品。
04
文库扩增与检测区（第二扩增区）
本区域为半污染区，区域功能：第二次的PCR扩增及对杂交捕获产物进行PCR扩增富集。[3]
注意事项：严防此区域扩增产物及气溶胶等对其它区域的污染，尽量减少人员在该区域与其它区域之间反复频繁流动，同时该区域的实验物品、实验服等尽量避免外带。[4]
仪器设备：医用冷藏冷冻箱、生物分析仪、普通PCR仪、QPCR仪、磁力架、移液器、普通打印机、可移动紫外灯、超净工作台和掌上离心机。[2]
消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和移液器吸头（带滤芯），专用办公消耗品。
NGS检测时常见的文库制备方法有杂交捕获法和扩增子法。以上文库制备区域的分区依据为杂交捕获法；若使用基于多重PCR扩增子的技术对肿瘤基因突变进行检测，在文库构建区域所需的分区只需文库制备区与文库扩增区域。
A 基于杂交捕获方法的肿瘤基因突变检测高通量测序实验室分区设计
B 基于多重扩增方法的肿瘤基因突变检测高通量测序实验室分区设计
基于多重扩增-扩增子方法的高通量测序实验室设计所需房间比杂交捕获方法所需房间较少，但不同实验室的检测方法可能有所不同，需按照当地实际开展的项目进行实验室的分区设计。(红色区域内为基于不同建库方法时，文库制备区域所需的房间) [2]
泛生子人类8基因突变联合检测试剂盒(半导体测序法)(国械注准20203400072)基于半导体测序平台开发，其建库方法采用泛生子一步法专利技术(中国发明专利 ZL201710218529.4)，一次扩增即可建成文库；同时文库扩增（即扩增二区）采用全自动加样系统GENETRON Chef（渝械注准20192220364）进行自动化文库扩增，不会将扩增产物及气溶胶释放到空气中，因此在现有分区的基础上可进一步节省实验空间。
采用泛生子基因检测试剂盒及测序仪器，可在四个分区中完成全部测序流程，极大节约了实验室空间，提高检测效率。
参考文献
[1] 二代测序（NGS）实验室建设原则及经验分享. 中山大学孙逸仙纪念医院病理科副研究员，细胞分子诊断中心副主任, 欧阳能太教授。
[2] 李金明.高通量测序技术[M].北京:科学出版社,2018
[3] 杨军, 张标, 叶庆. 分子病理实验室设计要求及体会[J]. 诊断病理学杂志, 2018, 25(11):57-58.
[4] 中华人民共和国卫生部． 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法[S]. 2010-12-06.
[5] 北京市临床检验中心, 北京医学会检验医学分会, 首都医科大学临床检验诊断学系,等. 高通量测序技术临床检测规范化应用北京专家共识(第一版通用部分)[J]. 中华医学杂志, 2019, 99(43):3393-3397.
泛生子（纳斯达克代码：GTH）是全球前沿的癌症精准医疗公司，专注癌症基因组学的研究和应用，提供癌症早期筛查、用药指导、预后监测、肿瘤新药研发服务等覆盖癌症全周期的产品与服务，致力于将创新基因组学技术，应用于与癌症相关的诊断、治疗，最终战胜癌症。