FLEX条件性表达腺病毒载体(Cre-On)是什么?
FLEX Cre-On系统由两对异型Lox-变体重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变体称为Lox2272,分别位于反向基因ORF(相对启动子方向而言)的两侧。 两种Lox-变体都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox-变体不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况时,目的基因由于其编码方向与启动子方向相反,所以不发生表达;在Cre的存在下,LoxP和Lox2272位点对分别重组,导致ORF方向反转为正向,且其中的一对重组位点将具有相同的方向,Cre会介导产生正向重组切割,继而分别留下一个不同的重组位点。 ORF的方向反转,使得目的基因可以在启动子的驱动下正常表达。由于ORF侧翼是两个不同的Lox-变体位点,所以即使存在Cre也不会进一步发生重组。
腺病毒载体首先是以质粒的方式构建并使用E. coli扩增,然后线性化后转染进入包装细胞。在包装过程中,位于两个反向重复序列(ITR)之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。对于上述的FLEX介导的Cre-On条件性表达腺病毒载体,FLEX Cre-On开关位于两个ITR之间。当病毒转导宿主细胞时,载体并以游离DNA的形式存在于细胞核中。
通过改造优化,我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区,前两者与病毒包装相关(这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中)。因此,运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),大大提高了生物安全性。
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