科研 | Food Chemistry：转录组与代谢组揭示辣椒果实颜色形成的分子机制（国人佳作）
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Integrative analysis of metabolome and transcriptome reveals the mechanism of color formation in pepper fruit (Capsicum annuum L.)
译名：转录组与代谢组揭示辣椒果实颜色形成的分子机制
期刊：Food Chemistry
IF：5.399
发表时间：2019.10
通讯作者：邹学校
通讯作者单位：湖南农业大学园艺学院
DOI号：10.1016/j.foodchem.2019.125629
实验设计
结果
1、辣椒果实的黄酮类代谢物分析
本研究比对不同时期、不同果色品种的辣椒果实中黄酮类化合物的含量，利用LC-MS/MS进行分析。共鉴定188种黄酮类化合物，其中94种黄酮、38种黄酮醇、8种儿茶酸、2种黄酮木脂素、20种黄烷酮、10种类黄酮、16种花青素。筛选差异表达的代谢物43-72种，主要是花青素、黄酮和黄酮醇（图1B-C），且C品种的含量显著高于其他3个品种，包括花翠素、木樨草素、金圣草黄素、槲皮素衍生物（图2）。此外，所有品种在不同时期的果实差异的代谢物较相似，且两个时期的类黄酮含量相似，可能与合成基因的表达下调有关。
花青素在未成熟的辣椒果实中起重要作用，本研究鉴定了16种花青素，主要为花翠素、花青色素、二甲花翠素（图2），且C品种中的花翠素及其衍生物（花翠素3,5-糖苷、花翠素3-O-芸香糖苷）显著较高，而4个品种中的二甲花翠素含量相似。此外，黑花青素和凯拉花青在C品种中含量较高，在其他品种中几乎没有。C品种中这些高积累的物质可能是导致果皮呈紫色的原因。
2、辣椒果实的类黄酮途径转录组分析
reads在参考基因组的比对率为92.73-94.48%，包含27132个基因，其中差异表达基因15227个。GO富集分析表明生物学进程、代谢进程、应激反应均富集较多。“细胞成分”、“细胞器”相关的基因也获得富集。分子功能类别则主要富集于“催化活性和结合”。在未成熟期，类黄酮和苯丙素通路的基因的转录水平高于成熟期，说明类黄酮主要在果实发育初期合成。C品种中苯丙氨酸解氨酶基因、羟基化酶基因、4-香豆酸:辅酶A连接酶基因的高表达促进了酰基辅酶A的合成，促进类黄酮前体化合物的合成，可能是导致C品种花青素、黄酮醇、黄酮含量较高的原因。D品种中查尔酮异构酶基因的高表达导致柚皮素的积累，而花青素、黄酮醇、黄酮积累较少，这与类黄酮3-羟化酶基因和类黄酮3’5’-羟化酶基因的低表达有关。D品种的黄酮醇合酶基因表达显著高于其他品种，但槲皮素和杨梅素含量却低于C品种，说明辣椒中存在其他同源基因催化黄酮醇的合成。
为了构建类黄酮合成的基因调控网络，本研究用4308个差异表达基因进行基因共表达网络分析。差异表达基因被分成11个类别（图3A），类别内的基因表达模式相似。结合代谢组分析，筛选出红色和粉色+模块是与类黄酮含量呈高度正相关的基因（图3B-D），即在类黄酮途径中起重要作用的基因。在粉色模块中，共表达的基因在C品种中高表达，表现出显著的品种特异性（图4A）。而红色模块中，聚类Ⅰ在C品种高表达，聚类Ⅱ在其他3个品种高表达（图4B）。为进一步确定模块中的基因功能，进行KEGG分析。KEGG富集结果显示，粉色模块的基因主要与代谢途径和次级代谢产物合成有关，有9个类黄酮合成的结构基因富集于苯丙素生物合成、黄酮/黄酮醇生物合成（图4C）。而红色模块的基因显著富集于蛋白质合成、光合作用、植物-病原体互作（图4D），表明黄酮类化合物和植物光合作用和病原响应的联系，且MYB-113调控基因聚类于红色模块，可能与类黄酮合成的调控有关。红色和粉色模块中有26个基因编码转运蛋白，在C品种中高度表达。这些基因主要编码溶质载体家族蛋白、ABC转运蛋白、多药及毒性复合物排出转运蛋白。其中，多药及毒性复合物转运蛋白参与原花青素的转运，ABC转运蛋白参与类黄酮跨膜转运。此外，红色模块中有13个基因编码转录因子，包括2个MYB转录因子和5个锌指蛋白；粉色模块有10个基因编码转录因子，包括2个WD家族、1个bHLH家族、1个MADS-box家族。本研究未能揭示这些转录因子的分子机制，但可确定这些调控基因影响类黄酮的合成。
为了进一步确定各基因的调控关系，筛选核心基因，本研究构建了基因调控网络。粉色模块筛选了58个基因构建网络（高度共表达）（图5A），核心基因包括FH11、COL2（锌指蛋白）、Capana01g003186/Capana02g003118（未知功能）、AIR12（生长素响应因子）、RPS2（抗病蛋白）、HD-ZIP。其中FH11和Capana01g003186连接类黄酮合成基因F3H、C4H、OMT1、转录因子COL2、DIV、转运蛋白MATE16、VPS41，表明这两个基因的重要性。红色模块由23个共表达基因组成，核心基因包括SLC40（溶质载体家族）、MYB113、R1B16/R1A-3（抗病蛋白）（图5B）。两个抗病蛋白基因连接ERF109（乙烯响应因子）、SLC40、MYB113等，表明抗性蛋白与黄酮类化合物合成的关系。
3、辣椒果实的类胡萝卜素途径分析
本研究定量分析了12种类胡萝卜素。结果表明果实发育初期类胡萝卜素含量较低，主要包括黄质、新黄质、β-胡萝卜素、叶黄素，说明类胡萝卜素的合成主要发生在果实发育后期，而绿色果实发育初期含量相对较高（图6A）。叶黄素（β-玉米黄质、玉米黄质、花药黄质、黄质、新黄质）在A和B品种积累较多，而辣椒质在C和D品种积累较多。因此，类胡萝卜素积累物质的不同，导致了不同品种果实的颜色差异。
本研究发现，基因PSY1（类胡萝卜素催化酶）在A/B/C品种中均高表达，使茄红素含量较高（图6）。番茄红素β-环化酶（LCYB）和番茄红素ε-环化酶（LCYE）是类胡萝卜素合成的关键酶，本研究发现LCYB和LCYE基因的表达与各品种果实内的α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素的积累相关，且LCYB和LCYE基因在A品种中表达较高（图6），这表明这两个基因协同调控类胡萝卜素通路，但功能可能有所不同。此外，细胞色素P450型单加氧酶对叶黄素的积累十分重要，在A品种中表达较高，因此A品种叶黄素积累较高（图6）。同时，两种羟化酶基因CHYB1/2在C和D品种高表达，但C和D品种的玉米黄质含量和A/B品种相似。此外，本研究发现辣椒质-辣椒红素合酶（CCS）基因在果实发育后期表达上调，而A和B品种的辣椒素含量较低，表明辣椒素的积累受CCS之外的基因调控。同时，玉米黄质环氧化酶（ZEP）和紫黄素脱环氧化酶（VDE）基因在品种间的表达无差异，但花药黄素和紫花药黄素含量却差异显著（图6）。
讨论
本研究利用四种不同果色的辣椒品种进行代谢组和转录组的比较，紫色品种中苯丙烷和黄酮类途径（槲皮素、叶黄素、金圣草素、花翠素）的基因高表达。共表达分析表明转录因子和转运蛋白（MYB113、WD68、SLC40）参与类黄酮途径。类胡萝卜素的代谢组分析表明，果实发育后期类胡萝卜素的积累表现显著的品种特异性。综上所述，本研究为辣椒果实在类黄酮和类胡萝卜素的合成途径提供新见解。
评论
为了深化理解辣椒果实的颜色形成机制，本研究对4种辣椒果实进行代谢组和转录组分析。结论表明紫色品种类黄酮合成和调控的基因高度表达，而各个品种在发育后期的叶黄素含量均有特异性，这与类胡萝卜素通路的下游基因表达差异有关。综上，本研究着重于类黄酮和类胡萝卜素途径，解释辣椒品种颜色不同的原因。
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