综述 | 加拿大麦吉尔大学Vahab D Soleimani教授：使用SMART-Seq的单肌纤维高分辨率基因组全表达分析
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：High Resolution Genome Wide Expression Analysis of Single Myofibers Using SMART-Seq
译名：使用SMART-Seq的单肌纤维高分辨率基因组全表达分析
期刊：Journal of Biological Chemistry
IF：4.106
发表时间：2019.11.21
通讯作者：Vahab D Soleimani
通讯作者单位：加拿大麦吉尔大学
DOI号：10.1074/jbc.RA119.011506
图1：SMART技术和Illumina接头整合到纤维mRNA中
实验设计
文章描述了一种可靠的方法，可从单个肌纤维中提取RNA，然后生成测序就绪的文库并进行整个转录组分析。使用这种技术，首先确定了在整个肌肉中发现的基因，这些基因不是由肌纤维产生的，而是由非成肌细胞类型产生的。为了证明该技术的有效性，接下来继续分析了从年轻小鼠和老年小鼠分离出的肌纤维之间整个转录组的差异。结果证明，smfRNA-Seq是确定基因纤维在不同条件之间发生的基因表达变化的实用工具。
结果
1从单个肌纤维中分离高质量的mRNA
该新方法的目的之一是使研究人员能够从单个肌纤维中测序RNA，而不会混淆其他细胞类型的存在。肌纤维RNA测序中潜在的有害信号来源是与纤维物理相关的肌肉干细胞（卫星细胞）的存在。使用该方法，发现在胶原酶消化缓冲液中添加终浓度为0.25％的胰蛋白酶后，卫星细胞几乎可以从纤维中完全去除。此过程不会损坏光纤本身，通过适当的EDL隔离，每只小鼠可产生200多个肌纤维（图2A）。但是，该缓冲区有效地去除了其卫星细胞的肌纤维（图2B-D）。
图2：从单个肌纤维中分离总RNA。
2 全肌肉和单肌纤维RNA序列比较分析
通过评估从smfRNA-Seq样品获得的独特读数的数量，试验发现单个肌纤维文库的测序深度可与全肌肉RNA测序相媲美（图3A）。当在NextSeq500上每条通道多路复用12个样本时，研究者从单个肌纤维样本中获得了平均2,400万次唯一读取，而在每条路多路复用10个样本时，研究者平均获得了3500万次唯一读取。这对应于82.42％的平均总体比对，平均唯一比对率为64.47％。单个肌纤维的整体表达谱也与整个肌肉非常相似，表明具有相似的高分辨率（图3A）。当执行主成分分析（PCA）时，单根纤维样本在两个轴上聚集在一起，但在PCA2轴上远离整个肌肉（图3B）。为了将单细胞技术的效率与增加的投入进行比较，研究人员还从5条和20条肌纤维生成了RNA-Seq库。当纤维数量增加时，样品变得与整个肌肉和单个肌纤维样品的相似性降低，技术重复之间的差异也更大（图3A，B）。这很可能是由于样品量过多，不过可以通过按比例放大方案来解决。
图3：来自单个肌纤维和整个肌肉的转录组的比较分析。
当更深入地研究单个基因时，发现单个肌纤维和整个肌肉之间有许多相似之处，但也有关键的区别。需要特别注意的是，研究人员观察到肌肉特定基因在单纤维和整个肌肉样本之间的读取次数相似（图4A-C）。Myh簇编码各种肌球蛋白重链蛋白（MyHC），它们是肌肉的运动蛋白也是不同纤维类型的基础。单纤维和整个肌肉之间的相似表达最终表明，测序的RNA仅来自肌纤维（图4A）。为了进一步确认，试验还显示了Ckm，即肌肉特异性肌酸激酶和ACTA1，其编码骨骼肌α肌动蛋白，这些基因具有与Myh相同的模式（图4B，C）。
图4：显示单个肌纤维和整个肌肉中成肌基因表达的UCSC分析。
单个肌纤维和整个肌肉转录组之间的差异是由非肌肉细胞引起的。使用smfRNA-Seq，研究人员能够完全去除这些不需要的细胞类型，仅对肌纤维进行测序。为了证明去除了肌纤维以外的细胞群，研究了多种不同肌肉驻留细胞类型的细胞特异性基因。研究者首先查看了卫星细胞标记Pax7的表达，发现Pax7在单纤维转录组中没有表达，尽管它存在于整个肌肉样本中（图4D）。作者还分析了成纤维细胞的标志物，即Col1a1和Thy1。正如这些基因所期望的那样，它们在整个肌肉中表达，但在单条纤维中不表达（图5A，B）。内皮细胞在单纤维样品中也被消耗掉，因为它们的标记物Kdr和PECAM1在整个肌肉中表达，但不在单纤维中表达（图5C，D）。作者还分析了Retn，以鉴定脂肪细胞、造血细胞的Cd34、Ly6a和ADGRE1的存在（图5E-J）。不出所料，在单个纤维转录组中，这些基因中的任何一个都没有表达，所有这些基因都存在于整个肌肉中。这些结果清楚地证明了仅对肌纤维测序而没有混淆细胞类型的smfRNA-Seq的纯度。
图5：显示单个肌纤维和整个肌肉之间非肌原性基因表达的UCSC分析。
3 年龄对单条肌纤维转录组的影响
为了验证该新方法在不同条件下分析肌纤维转录组变异的实用性，研究人员对分离了不同月龄（1和3个月大）和年龄（19个月大）小鼠的EDL肌纤维进行了smfRNA-Seq。使用该技术，研究人员可以看到年轻的和年老的肌纤维的转录组明显不同。在旧的肌纤维中，观察到许多基因的失控，与年轻的肌纤维相比，有181个基因在老年人中显着差异表达（padj <0.05）（图6A，B）。主成分分析（PCA）展示了从1个月大的小鼠中分离出的年轻肌纤维如何在PC2轴上与旧肌纤维聚集在一起（图6E）。通过对年轻和老肌纤维之间变异最大的基因的GO分析表明，衰老过程中失控的途径包括小分子（如盐和金属离子）的运输以及胶原蛋白的合成。在衰老中显着失调的基因的其他示例包括Actc1，Myl1，Dkk3，Atf3，H19，Nos1和Ndn（图7A-H）。这些是涉及骨骼肌结构，代谢，体内平衡和稳态的基因。
图6：来自年轻和年老小鼠的单个肌纤维之间的转录组比较分析。
图7：IGV分析显示年轻Vs老龄肌纤维之间所选差异表达基因的表达。
结论
smfRNA-Seq是一项功能强大的新技术，可对单个肌纤维进行高分辨率全转录组测序。本研究中，试验提供了一种可以以足够高的浓度和质量从单个肌纤维中成功分离出RNA的方法，并与SMART-Seq技术一起使用，从而生成了高质量的用于测序的cDNA文库。从smfRNA-seq获得的数据的深度和分辨率与全肌肉RNA相当。从单个纤维测序的RNA不会显示出对各种非肌源性细胞特异的基因的富集，这清楚地表明其仅对肌纤维RNA进行了测序。这为研究人员提供了一种新颖的工具，便于科研人员在发育，衰老和疾病期间纤维类型之间探究转录组变化。
评论
骨骼肌是一种异质组织。组成肌肉组织的单个肌纤维在其代谢和收缩特性方面存在差异。尽管有生化和组织学方法可以研究肌纤维异质性，但仍缺乏有效的方法来分析单个肌纤维的整个转录组。本实验开发出单条肌纤维RNA-Seq（smfRNA-Seq）的方法，通过将单纤维分离与RNA模板（SMART）技术5'端的转换机制结合起来，分析单个肌纤维的整个转录组。该方法提供了单个肌纤维的高分辨率全基因组表达谱。使用smfRNA-Seq，分析了新肌纤维和旧肌纤维转录组的差异，以验证这种新方法的有效性。使用smfRNA-Seq，对来自年轻和年老小鼠的单个肌纤维进行了比较基因表达分析。数据表明，衰老导致肌纤维中代谢和结构基因表达的显着变化，此外也表明smfRNA-Seq是研究骨骼肌组成中与发育，疾病和年龄相关的动力学的强大工具。
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