科研 | 西北农林科技大学：综合代谢组和转录组数据揭示苹果果实发育和成熟过程中代谢组学变化的分子机制（国人佳作）
编译：一个矫情的农民，编辑：Tracy、江舜尧。
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苹果是蔷薇科植物的一员，是世界上温带地区最重要的经济水果作物之一。苹果在成熟过程中伴随着味道、硬度、香气和颜色的巨大变化，而这些是影响果实质量的主要因素，因此，对苹果发育成熟过程的研究有助于我们更好地了解果实品质的形成。苹果的发育从开花到果实成熟大约150天呈简单的s型生长曲线。以往对苹果发育的生理研究表明，代谢产物的合成/降解对果实品质有影响，如甜度、酸度、颜色和其他有益于人体健康的植物化学物质。尽管有几项研究对苹果进行了代谢分析，但缺乏对苹果及其发育过程进行广泛而全面的研究，以深入了解果实品质形成与果实发育的关系。本研究利用代谢组学和转录组学揭示了苹果发育成熟过程中的代谢变化和转录调控，为了解商业苹果重要品质性状的分子和代谢基础提供了依据。
论文ID
实验设计
实验结果
1. UPLC-MS分析苹果在四个发育阶段的代谢动态
为了研究苹果发育过程中的代谢变化，作者采用基于LC-MS对苹果的四个发育阶段进行了代谢分析。如图1A所示，不同发育阶段的果实样品表现出明显的分离，每个果实发育阶段的三个重复具有相似的PC评分，表明果实代谢产物在不同发育阶段呈现出不同的变化，并且在重复之间表现出较小的分离。经过鉴定和分析，作者共检测出462种代谢物，代谢物归为不同类别，包括氨基酸及其衍生物、碳水化合物、有机酸、醇和多元醇、脂类、核苷酸及其衍生物、花青素和原花青素、黄酮、黄酮醇、黄烷酮、奎宁酸及其衍生物、植物激素等，如图1B所示，并通过层次聚类进一步分析，结果表明每个果期的三个重复聚集在一起，表明组内的差异很小。热图结果显示，超过一半的代谢物在PS1期的含量高于其他阶段，这种现象主要是由于PS1经历细胞分裂，PS2至PS4阶段进行细胞扩张，从而对代谢物含量产生稀释作用；另一方面，一些代谢物在苹果的完全成熟阶段PS4表现出高积累水平（图1B中的箭头），表明这些代谢物的积累与苹果的成熟过程有关。此外，根据四个发育阶段间代谢物的变化作者进行聚类分析（图1C），20个簇显示了代谢物变化的明显聚集，变化趋势如图1D所示。
图1 苹果发育和成熟的动态代谢组研究
(A)果实四个发育阶段代谢组学数据的主成分分析。“mix”是所有水果样品的均衡混合。(B)苹果四个发育阶段的代谢产物热图。颜色表示UPLC-MS通过平均峰值响应区确定的不同发育阶段各代谢产物的相对含量。(C)对462种代谢产物在果实发育4个阶段的变异趋势进行聚类分析。(D)对20种代谢产物的变异趋势进行聚类分析。PS1、2、3和4表示苹果发育的4个阶段：PS1代表花后27天；PS2代表花后84天；PS3代表花后125天；PS4代表花后165天。
2. 苹果发育和成熟过程的初级代谢产物研究
2.1 糖、糖醇及其磷酸盐的代谢
苹果中主要的可溶性糖是果糖（Fru）、蔗糖（Suc）和葡萄糖（Glu）。这三种可溶性糖的含量变化趋势相似，从PS1到PS2都有明显的快速上升，从PS2到成熟期略有增加（图2）；此外，松三糖和阿拉伯糖的含量也呈现出与上述三种主要可溶性糖相似的变化趋势。结果表明，决定果实甜度的糖积累主要发生在PS1～PS2阶段，就糖醇而言，山梨醇、甘露醇和半乳糖醇的含量在前三个阶段呈现平稳变化，但在完全成熟阶段PS4下降（图2），然而，脱水葡萄糖醇的含量从PS1迅速上升到PS2，并且在随后的三个阶段中变化很小。对于磷酸糖而言，大多数磷酸糖在PS1处表现出明显的高积累水平，并在随后的阶段迅速下降至低含量，然而，葡萄糖酸内酯的含量呈上升趋势，古洛内酯在果实发育过程中表现出较小的变化（图2）。
图2 UPLC-MC在4个果实发育阶段检测糖代谢产物
分析了苹果开花后27天(PS1)、84天(PS2)、125天(PS3)和165天(PS4) 4个果实发育阶段。以开花后27天的第一阶段为校准，Fructose#是指额外使用GC-MS检测果糖含量，因为研究中没有使用广泛靶向的LC-MS代谢组学方法来鉴定果糖。
2.2 苹果发育过程中的有机酸代谢
苹果酸的含量随着果实的发育和成熟而不断下降（图3A）。琥珀酸在果实发育过程中的积累量也呈现出明显的下降趋势，从果实早期PS1到果实膨大期PS2迅速下降；同样，α-酮戊二酸的含量在PS1时显著升高，随后迅速下降；富马酸也呈现出这种变化趋势，在PS1处积累了大量的富马酸，并在随后的三个阶段将其含量降至未检出水平；然而，柠檬酸的含量在四个果实发育阶段表现出有限的变化（图3A）。综上所述，上述有机酸是TCA循环的中间产物，在果实发育过程中，它们的含量通常会明显降低。
此外，莽草酸含量在果实发育过程中呈下降趋势，在PS2时迅速下降。而酒石酸和抗坏血酸在PS4成熟期积累到较高水平。对于奎宁酸及其衍生物，四个时期的绿原酸和新绿原酸含量变化有限，而奎宁酸含量随着果实发育而明显下降（图3A）。其它有机酸和奎宁酸衍生物的变化如图3B所示，大量的有机酸在成熟阶段PS4积累到较高水平；然而，大多数奎尼酸酯衍生物在果实早期PS1呈现出高积累水平（图3B）。
图3 四个果实发育阶段有机酸和奎宁酸(及其衍生物)的变化
(A) 15种代表性有机酸的热图:以开花后27天的第一阶段(DAA)为校准，在热图上显示4个阶段各代谢物的倍数变化。PS1、2、3和4分别代表花后27、84、125、165天的果实发育阶段。Fructose#是指额外使用GC-MS检测果糖含量，因为研究中没有使用广泛靶向的LC-MS代谢组学方法来鉴定果糖。
2.3 氨基酸及其衍生物的积累
图4显示了水果发育过程中氨基酸及其衍生物的变化，包括26个氨基酸和39个氨基酸衍生物。氨基酸的积累概况如图4所示，作者根据氨基酸的变化趋势将其进一步划分为四大类。第1组(红框)表现为在成熟期PS4积累水平较高，呈上升趋势，第1组包括天冬酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸。第2组(蓝框)在整个果实发育过程中积累量呈下降趋势，主要由亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸、高半胱氨酸、酪氨酸和丝氨酸组成。第3组(绿框)呈单一的s型趋势，在PS2期达到高峰，第3组以酪氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸为主(图4)。第4组(紫框)前3期PS4积累量呈下降趋势，成熟期PS4积累量增加，主要由均谷氨酸、缬氨酸、戊氨酸、色氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸组成。而异亮氨酸积累水平在PS2时下降至最低点，随后上升，在PS4时达到最高水平(图4)。
图4的热图显示了在果实发育过程中氨基酸衍生物的积累变化。一般来说，检测到的大部分氨基酸衍生物在PS1早期表现出较高的积累水平，但也有一些是例外，在PS1中含量较低，如乙酰色氨酸、蛋氨酸亚砜等；此外，果实成熟期PS4中α-乙酰-l-谷氨酰胺、n-乙酰-1-亮氨酸和n-乙酰天冬氨酸等多种氨基酸衍生物积累大量(图4)。
图4 UPLC-MC在四个果实发育阶段检测到氨基酸(左)及其衍生物(右)
以开花后27天第一阶段(DAA)为校准，在热图上显示了4个阶段各代谢物的倍数变化。PS1、2、3和4分别代表花后27、84、125、165天的果实发育阶段。
2.4 苹果发育和成熟过程中次生代谢产物的积累
在这项研究中检测到许多次级代谢化合物，特别是黄酮类化合物。初步鉴定出207种次生代谢物，其中黄酮类化合物104种，其他次生代谢物103种（其中未分类代谢物25种）。作者将次级代谢物分为这两类，并在图5中用热图显示出来。
图5 UPLC-MC检测到的黄酮类和其他次生代谢产物在四个果实发育阶段的积累谱图
PS1、2、3和4分别代表花后27、84、125和165天的果实发育阶段。每个阶段都进行了3个独立的重复。
2.4.1 次生代谢产物(黄酮除外)的积累
（1）苯甲酸类
作者首先对苯甲酸和羟基肉桂酰衍生物在苹果中的积累进行了分析（图5）。对苯甲酸而言，氨基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸-O-己糖苷、没食子酸O-己糖苷和丁香酸O-葡萄糖苷在果实早期PS1积累量最高，在随后的三个阶段积累量较低。然而，苯甲酸在PS3处出现峰值积累水平，在PS4处出现最低水平（图6）。香兰素含量呈上升趋势，在PS4处含量最高，而没食子酸则随四个阶段呈下降趋势（图5和图6）。
图6 在四个果实发育阶段检测到的具有代表性的次生代谢物
以开花后27天第一阶段(DAA)为校准，在热图上显示了这4个阶段各代谢物的倍数变化。PS1、2、3和4分别代表花后27、84、125、165天的果实发育阶段。每个阶段都进行了3个独立的重复。
（2）羟基肉桂酰衍生物
实验中总共有25个代谢物被划为羟基肉桂酰衍生物。在果实早期PS1积累了丰富的羟基肉桂酰衍生物，如阿魏酰丁香酸、咖啡醛等。同样，咖啡酸、阿魏酸、香豆酸和香草酸的积累水平呈现一个下降的趋势在果实发育(图5和6)，然而，少量的代谢物在PS4成熟阶段高水平积累(图5)。
（3）多胺
多胺的积累水平的三种类型表现出不同的变化趋势：PS1和亚精胺积累了最高水平迅速下降到一个很低的水平以下阶段；精胺在水果开发过程中变化平稳，在PS3上略有下降；腐胺在前三个阶段呈下降趋势，在PS3时最低，在PS4时呈上升趋势(图6)。
（4）激素
有6种代谢产物被鉴定为植物激素，其中3种常见的植物激素为IAA(吲哚3-乙酸)、JA(茉莉酸)和ABA(脱落酸)。IAA积累在PS1期表现为较低水平，在果实膨大阶段PS2迅速增加至峰值水平，然后在果实成熟阶段PS3和PS4下降至较低水平。JA含量从PS1到PS2迅速下降，PS3和PS4中JA含量维持在较低水平，但在果实成熟阶段(PS1到PS3) ABA积累水平呈上升趋势，在PS3达到峰值(果实开始成熟着色)，从PS3到完全成熟阶段PS4 ABA积累水平略有下降，表明ABA在果实成熟过程中发挥了一定的作用(图6)。
2.4.2 类黄酮代谢
黄酮类化合物的代谢是苹果中含量最丰富的一类次生代谢产物。共有104种代谢物归入黄酮类，在此，作者阐述了不同类黄酮在果实发育过程中的变化。
（1）黄酮和黄酮c-糖苷
在104种代谢产物中有41种归属于黄酮和黄酮C-糖苷。在果实发育过程中，黄酮和黄酮C-糖苷的变化是动态的，例如，麦黄酮在前两个阶段含量较高，在PS3时最低，在PS4时略有增加。木犀草素、天麻黄酮、白杨素等在PS1积累最多，随后迅速下降，然而，川皮苷和橘皮素在PS2和PS3处表现出较高的积累水平，而在PS1和PS4处的积累水平较低（图5和图6）。与黄酮类化合物相比，果实发育过程中黄酮C-糖苷的变化更为复杂，各成员之间的共同变化趋势有限；然而，四种木犀草素C-糖苷在成熟期PS4积累了较高的含量（图5）。
（2）黄酮醇
共有29种代谢物归属于黄酮醇类。多数黄酮醇在果实发育过程中呈现出相似的变化规律：在果实早期PS1积累高水平，在果实后期迅速下降，PS3阶段最低，然后在成熟期PS4略有上升（图5）。这种变异模式包括常见的黄酮醇，如槲皮素、山奈酚、二氢山奈酚、杨梅素、紫杉醇、三叶草素等，但部分黄酮醇在成熟期PS4表现出较高的积累水平，如甲基槲皮素O-己糖苷、异鼠李素O-己糖苷、异鼠李素5-O-己糖苷、槲皮素7-O-芦丁苷、芦丁、刺槐素等（图5）。
（3）黄烷酮
11种黄酮在4个发育阶段的积累规律基本一致。这11种黄酮含量分别为：新橙皮苷、柚皮苷、樱桃甙、柚皮素、根皮素、圣草酚、橙皮苷5- o -葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮素查尔酮、枸橘苷和阿夫儿茶精，三种代表性黄酮(柚皮素、根皮素和草二醇)的倍数变化如图6所示。
（4）原花青素和花青素
原花青素，也被称为缩合单宁，广泛分布在许多类型的水果中，并被认为发挥不同的作用，包括抗氧化。花青素是成熟苹果呈红色的主要天然色素，除原花青素A2外，原花青素A1、B2和B3在PS1中积累量较高，在成熟期PS4积累量较低。原花青素A2在PS1中含量极低，在PS2 ~ PS4中含量较高(图5、6)。在花青素方面，本研究检测到三种花青素，分别是松香苷o -己糖苷、花青素3- o -葡萄糖苷和花青素o -丁香酸。松香苷o -己糖苷在PS1中积累量最高，随后迅速下降，花青素3- o -葡萄糖苷和花青素o -丁香酸在PS1和PS4成熟期积累量较高，而在PS2和PS3期积累量极低(图6)。
（5）儿茶素衍生物和异黄酮
儿茶素衍生物是一种天然苯酚和从儿茶中提取的抗氧化剂。本研究共检测到10种儿茶素衍生物。大多数儿茶素衍生物在果实早期PS1积累较高水平，在PS3和PS4积累较低水平，例如，儿茶素和表儿茶素的积累水平在四个阶段中呈下降趋势，在PS3和PS4水平较低，而原儿茶酸o -葡萄糖苷的含量则随着果实发育而增加(图5)。异黄酮类有5种代谢物，随着果实发育呈现出不同的变化趋势。
2.5 苹果发育和成熟过程中代谢物间的相关性
为了研究代谢物在苹果发育和成熟过程中的相互关系，作者对149种具有代表性的代谢物进行了相关性分析。通过计算Pearson相关系数来评估各代谢物的相关性，149种代表性代谢物之间的相互关系通过图7中的热图显示出来。如图7所示，糖与代谢物类别（如核苷酸（放大部分）、几种有机酸、羟基肉桂酰衍生物、类黄酮等）表现出明显的负相关，然而，糖醇的相关性相对较少。核苷酸与许多其他次级代谢物类别呈现广泛的正相关，包括苯甲酸、羟基肉桂酰衍生物（放大部分）、生物碱、胆碱、黄酮醇、黄烷酮和儿茶素衍生物（图7中的箭头）。琥珀酸、莽草酸、α-酮戊二酸和富马酸四种有机酸与苯甲酸、羟基肉桂酰衍生物（没食子酸、咖啡酸、阿魏酸、香豆酸和香草醛酸）呈显著相关，此外，这四种有机酸与几种类黄酮呈高度相关（图7中的箭头），而苯甲酸和羟基肉桂酰衍生物与生物碱、胆碱（放大部分）和类黄酮（包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮、原花青素和儿茶素衍生物）具有高度相关性（图7中的箭头）；儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原儿茶醛与柚皮素、根皮素、圣草酚、橙皮苷、原花青素A1等呈高度正相关（图7）。相关分析为苹果发育和成熟过程中初级代谢和次级代谢之间的联系以及重要的代谢物之间的相关性提供了线索。
图7 代谢物与代谢物相关性热图
从462个代谢物中选取149个具有代表性的代谢物进行相关性分析。采用Pearson算法，利用R软件评估代谢物相关系数。热图的每一平方表示皮尔逊分析得出的相关系数得分，代表代谢物标题行与代谢物标题列之间的相关性。
2.6 不同果实发育阶段积累的代谢产物差异
为了研究果实不同发育阶段代谢物的显著变化，作者对PS1与PS2、PS2与PS3、PS3与PS4之间的差异代谢物进行了分析（图8）。在PS1和PS2之间共鉴定出111种显著的差异代谢物，其中25种上调代谢物和86种下调代谢物（图8A）。对于PS2和PS3，29种代谢物显著上调，90种代谢物下调。这些结果表明，从果实早期PS1到果实膨大期PS2，大部分差异代谢产物均下调，而PS3与PS4之间的差异代谢物显示出许多上调代谢物（83种上调代谢物和18种下调代谢物），表明在果实成熟期PS4积累了大量代谢物（图8a），这三种组合中不同代谢物的热图也清楚地显示了上述变化趋势（图8C）。此外，如图8B所示，这三种组合共有19种差异代谢物。PS1与PS2、PS2与PS3共有45种差异代谢物，而PS2与PS3、PS3与PS4有47种共同的差异代谢物。
图8 果实不同发育阶段的代谢物差异积累
(A)PS1与PS2、PS2与PS3、PS3与PS4果实发育阶段代谢物积累差异的火山图；(B)PS1与PS2、PS2与PS3、PS3与PS4之间代谢产物差异的Venn图；(C)PS1与PS2、PS2与PS3、PS3与PS4之间代谢产物差异的热图。每个阶段的三个独立重复也显示在热图中。(D)PS1 vs PS2，PS2 vs PS3，PS3 vs PS4之间差异代谢物的KEGG通路分配：圆点颜色代表p值，圆点大小代表差异代谢物的数量。PS1、2、3和4分别代表花后27、84、125和165天的果实发育阶段。
此外，为了研究差异代谢物的相关生物学过程，作者进行了KEGG途径分析。如图8D所示，PS1与PS2的差异代谢物显著参与类黄酮生物合成、苯丙酸生物合成、异黄酮生物合成等，对于PS2和PS3，差异代谢物分为苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢等；然而，PS3与PS4的差异代谢物参与异黄酮生物合成、蛋白质消化吸收等（图8D）；同时，花青素生物合成的富集与色素积累从PS3到PS4一致。作者将所有差异代谢物映射到KEGG途径，以发现不同果实发育阶段之间类黄酮的变化：所有差异代谢物中有14种被映射到类黄酮生物合成途径，6种差异代谢物被映射到苯丙素生物合成途径。与PS1相比，PS2中类黄酮和苯丙酸生物合成途径上的20种代谢物的含量都有所下降，表现为果实膨大过程中类黄酮和苯丙酸的合成受到抑制。在PS2 vs PS3中，7种差异代谢物被定位到苯丙素生物合成途径，5种被定位到类黄酮生物合成途径。除对香豆醇外，这13种差异代谢物在PS3中的含量均下降。在PS4和PS3中，只有5种代谢物被映射到苯丙素生物合成途径。
2.7 与初级和次级代谢相关的基因表达模式-基因和代谢物联合分析
为了进一步研究转录因子在苹果发育和成熟过程中的调控作用，我们对同样的4个发育阶段的果实样品进行了转录组分析。为了探讨苹果发育过程中代谢变化的转录调控作者将不同发育阶段的差异表达基因（DEGs）分配到代谢途径中，如图9所示，红色或蓝色方框表明，在果实发育过程中，代谢物的含量在增加或降低。小正方形表示相应路径中涉及的差异基因，正方形颜色表示差异基因的倍数（红色上调，蓝色下调），方框“1”、“2”和“3”上方的数字分别表示PS1与PS2、PS2与PS3和PS3与PS4之间的差异基因。
为了探索代谢组和转录组之间的潜在联系作者进一步研究了被指定为初级代谢和类黄酮途径的差异基因（图9）。结合转录组数据，PS1和PS2在代谢途径中的差异基因最多，并且有大量的差异基因被下调，这与PS1之后代谢物含量的大幅度下降相一致；然而，参与初级代谢的大多数差异基因在PS2 vs PS1中上调（图9）。果实早期基因表达的增强和初级代谢产物为果实发育过程中的代谢通道提供了前体物质。如图9所示，参与TCA循环和氨基酸代谢的基因在果实发育过程中被激活，主要在PS1与PS2和PS2与PS3组合中，而代谢组学数据显示，在果实发育过程中，TCA循环的中间产物，如苹果酸、延胡索酸和琥珀酸的含量明显降低，这意味着参与TCA循环的基因被激活，但相应的代谢物被作为下游代谢的底物被消耗。对于PS2和PS3（果实膨大期），尽管与PS1和PS2相比，分配给初级代谢的差异基因数量减少，但大多数差异基因上调（图9），这表明，参与初级代谢的基因转录本随着苹果的膨大而被激活。在色素沉积期（PS3 vs.PS4），不同代谢途径中有限的基因发生了变化，表明有助于代谢谱建立的基因表达在PS3（预成熟期）完成，在PS4时稳定，而在PS1和PS2中，参与类黄酮途径的大多数基因都明显下调，尤其是一些关键的控制基因：CHS（查尔酮合成酶基因）、F3H（黄烷酮3-羟化酶基因）等（图9）。类黄酮基因的下调可能是导致类黄酮含量降低的原因之一（图5），有趣的是，F3oGT（UDP葡萄糖黄酮类3-O-葡萄糖基转移酶）的mRNA丰度在PS1 vs PS2中呈现明显的下调，而F3oGT在PS2和PS3中显著上调（图9）。考虑到在代谢物积累之前的基因激活，在PS3（着色前）F3oGT的上调可能是着色期PS4果实色素积累的原因，此外，与差异代谢物相关的PS2与PS1之间的差异基因被映射到KEGG途径。结果还表明，PS2与PS1中参与类黄酮和苯丙素生物合成的差异基因大部分下调，与代谢产物的变化趋势一致。
结论
在果实发育的四个阶段中，大多数糖的积累水平都呈上升趋势，而有机酸则呈现出明显的下降趋势。许多类黄酮在果实发育初期含量相对较高，在随后的发育阶段迅速降低。相关性分析突出了水果发育和成熟过程中初级和次级代谢之间的相互联系，表明糖和次级代谢物之间存在显著的负相关，此外，转录组分析结果表明，从果实早期到果实成熟期，参与TCA循环的差异表达基因（DEGs）上调，类黄酮途径调控基因的广泛下调可能是导致果实类黄酮含量迅速下降的原因。这些数据对果实发育过程中的代谢组学变化进行了全面的分析，为商品苹果重要品质性状的分子和代谢基础提供了更广泛和更好的理解。