科研 | Nat Commun：空间蛋白质组学定义了由高尔基体蛋白捕获的运输囊泡含量
编译：微科盟阿温，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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分泌途径和内吞途径之间的细胞内交通由囊泡载体介导。由于囊泡中间产物是短暂的、低丰度的和难以纯化的，许多细胞器的载体蛋白质组定义不清。在本文中，我们将囊泡再定位与细胞器蛋白质组学和贝叶斯分析相结合，以确定不同内质体衍生囊泡的含量，这些囊泡的目的地是高尔基体反面膜囊网状结构（TGN）。高尔基体蛋白卷曲螺旋蛋白golgin-97和GCC88在TGN处捕获内质体衍生的囊泡，被重新定位到线粒体，随后重定位的囊泡的含量由细胞器蛋白质组学确定。在本研究中，我们发现golgin-97重组45个完整膜蛋白和51个外周膜蛋白，证明了golgin-97和GCC88共有一类不同的囊泡，以及不同的高尔基体蛋白特有的各种物质，这些结果阐明了一种通过结合急性细胞重组和高分辨率空间蛋白质组学来分析细胞内亚蛋白质组的策略。
论文ID
实验设计
1. 使用常规串联质谱的多路复用技术获得蛋白质的图谱。
2. 使用支持向量机（SVM）的监督机器学习，以及通过T-增强高斯混合模型（TAGM）方法使用贝叶斯统计建模，将单个轮廓与已知细胞器标记的轮廓进行匹配，从而预测每种蛋白质的亚细胞定位。
3. 利用LOPIT-DC分析golgin-97-mito影响细胞中的蛋白质及其分类。
4. 采用golgin-97-mito邻近生物素标记实验捕获高尔基体蛋白。
实验结果
1. LOPIT-DC在线粒体搬迁的golgin-97和GCC88上
图1b，1d中显示了我们使用的LOPIT-DC工作流程，其中LOPIT-DC应用于表达golgin-97-mito、GCC88-mito或线粒体TMD (mito)的Flp-In 293细胞中作为对照（图1c）。我们使用常规串联质谱(MS2)的多路复用技术，在每次处理的三个独立重复中获得了大约6000个蛋白质的图谱（补充数据1）；然后，通过使用支持向量机（SVM）的监督机器学习，以及通过T-增强高斯混合模型（TAGM）方法使用贝叶斯统计建模，将单个轮廓与已知细胞器标记的轮廓进行匹配，从而预测每种蛋白质的亚细胞定位（图1d）。其中，后者考虑到了在对位于多个位置或未知功能区室的蛋白质以及在细胞内动态移动的蛋白质进行分类时产生的不确定性，因此提供了更丰富的空间蛋白质组学数据的总体分析。
MS2基于串联质谱标签（TMT）的定量性能可能会受到具有与目标肽相似性质的污染肽干扰，但如果确实发生这种情况，则必须通过同步前体选择质谱（SPS-MS3）中的另一轮离子选择和裂解来解决。MS2分析的LOPIT-DC数据显示，细胞器的有效分离具有良好的分辨率（补充图1a，b）。由于我们应用LOPIT-DC的目的不是为了解决不同细胞器整体轮廓的细微差异，而是为了检测样品之间假定的囊泡蛋白轮廓的明显变化，因此通过使用更简单和更便宜的MS2方法满足了我们的要求。
为了鉴定由于线粒体golgins的表达而转运到线粒体的蛋白质，我们首先通过应用一个独立的预过滤步骤来利用LOPIT-DC数据的空间信息。因此，在随后的分析中，TAGM预测定位于线粒体或细胞核的蛋白质被丢弃，这些蛋白质很可能是与我们的生物学问题无关的线粒体和核蛋白，丢弃它们可以更容易地识别mito细胞系中高尔基体蛋白向线粒体方向转移的蛋白质（补充图1c）。
接下来，我们使用贝叶斯非参数双样本检验（Bayes因子）对golgin-mito细胞和对照细胞之间蛋白质谱的一般变化进行了定量分析。为了量化向线粒体转变的蛋白质图谱，我们计算了线粒体比率，正如所料，当我们将golgin-97-mito的LOPIT-DC与mito对照组进行比较时，我们得到的最强结果是golgin-97和TBC1D23（图1e）；同样，当比较GCC88mito和mito对照组时，GCC88的命中率最高（图1f）。Golgin-97-mito比GCC88-mito有更多的高分蛋白，这表明Golgin-97具有更大的累积囊泡能力，这与我们先前的观察结果一致，并通过免疫荧光显微镜定量进一步证实（图1g和补充图2a）。
接下来，我们根据已证实的实验观察结果，设定蛋白质重新定位到线粒体的阈值（图1e，f），主要标准是，当mito与golgin -97- mito比较时，该阈值应包含WDR11复合体的所有亚基(WDR11, FAM91A1和C17orf75)，而当mito与GCC88-mito比较时，该阈值不包含（图1a、e、f）。该阈值的应用还预测了ATG9A和Furin（通常驻留在高尔基体膜和内体中）作为golgin-97-丝裂原捕获的囊泡货物（图1e）。我们通过免疫荧光（图1h，i）验证了这一点，证明将其循环到高尔基体的囊泡可以被golgin-97捕获，但不能被GCC88或GCC185捕获，这些数据共同证明了我们对LOPIT-DC数据进行贝叶斯分析的有效性。
图1 LOPIT-DC在线粒体搬迁的golgin-97和GCC88上
（a）对线粒体重新定位的golgin-97应用邻近生物素化鉴定其与高尔基囊泡内体上的TBC1D23和WDR11复合物的相互作用。（b）LOPIT-DC工作流程概述。细胞通过差速超速离心进行轻度溶解和分离。（c）用1 μg/mL强力霉素对稳定表达强力霉素诱导的mito、golgin-97-mito和GCC88-mito的Flp-In 293细胞进行48小时的免疫印迹。（d） LOPIT-DC的主成分分析（PCA）投影显示分类前、SVM分类后和TAGM分类后的细胞器标记。（e、f） MitoRatio与Bayes因子分析的结果，比较mito与golgin-97-mito和GCC88-mito。g用LOPIT-DC的Flp-In 293细胞共焦显微图的定量（补充图2a），测量线粒体TGN46的平均强度与其在高尔基体的强度的比率。（h、i）用内源性ATG9A或外源性Furin-GFP染色的HeLa细胞的共聚焦显微图表达所示的golgin-mito 结构(HA)。
2. golgin-97专用物
沿着逆行路线运输到高尔基体的蛋白质处于不断流动的状态，因为它们在整个内质体网络中不断循环。与这一现象相一致，我们观察到在那些受golgin-97-mito影响的细胞中，内质体网络的蛋白质有很强的富集现象，这包括由多个定位数据库和我们LOPIT-DC分析分类的蛋白质，这些蛋白质定位于核内体、溶酶体、高尔基体或质膜（PM），或存在于囊泡上（补充数据2），其中，共有45种跨膜蛋白受到强烈影响，包括IGF2R（CI-MPR）、M6PR（CD-MPR）和TGN46，它们是golgin-97和golgin-245捕获的囊泡的已知物（图2a，b），此外，我们还检测到5个内质体与高尔基体囊泡和反式高尔基体融合的陷阱。在我们的对照中，这些跨膜蛋白中的大多数具有类似于核内体的特征，然后在LOPIT-DC分析中，由于golgin-97-mito的作用，这些跨膜蛋白转向具有更多的线粒体特征（图2c，d）。这些变化是局部的，这与在实验过程中囊泡的积累是一致的，一些货物蛋白仍在运输中，或在囊泡中逃脱了线粒体golgins的捕获。基于这些结果，我们将这些跨膜蛋白定义为golgin-97捕获的囊泡货物。
逆向运输到反面膜囊通常具有挑战性，在这不同的途径中，AP-1衍生囊泡的含量是最好的，我们检测到16种已知的AP-1蛋白明显受到golgin-97-mito的影响，这与之前关于AP-1小泡与golgin-97和golgin-245结合的报道一致，其中，TVP23是一种特性很差的TGN蛋白，它与酵母内体到高尔基体的运输以及植物中TGN的分泌有关。我们发现TVP23B通过golgin-97-mito（而不是GCC88-mito）特异性地重新定位到线粒体（图2e、f和补充图2b），Furin也是AP-1的一种货物，显示出类似的结果（图1i），总之，这支持了GCC88捕获网格蛋白/AP-1衍生囊泡的能力最小的结论。
在逆行运输的研究中，一个重要的复杂因素是许多货物蛋白含有多种分类基序，这些基序允许来自多种分类途径的适配器与之结合。除AP-1外，我们还鉴定了29个其他货物，这些货物可能来自golgin-97和golgin-245捕获的其他分选途径的运输囊泡（图2b），因此，这些蛋白质是未来可能被用来进一步阐明这些途径的候选蛋白，其中有一个例子，是自噬蛋白ATG9A和它的伴侣SERINC1，已知它们被AP-4适配器分类成从TGN分泌到细胞外围的小泡。但我们的分析没有检测到AP-4或其辅助蛋白RUSC1和RUSC2，这表明ATG9A和SERINC1位于一个由尚未定义的分选途径衍生的逆行囊泡上。ATG9A是自噬体形成的重要调节因子，丝氨酸蛋白是HIV的限制因子，它们被golgin-97-mito重新定位到线粒体上，为进一步研究这些蛋白的作用提供了有价值的分析方法。
图2 golgin-97特异性囊泡的高尔基体/内质体膜蛋白
（a） MitoRatio与Bayes因子分析：mito与golgin-97-mito的比较显示，所有的命中（蓝色）都定位于高尔基体/内体网络，也是跨膜蛋白。（b）所有点击按从左栏到右栏的顺序显示，以MitoRatio分数递减为基础。（c） mito的LOPIT-DC和golgin-97-mito的PCA投影显示SVM分类和所有来自a，b的命中率。（d） TMT报告子：每个复制的线粒体与golgin-97-mito组分的蛋白质离子分布，显示了已知线粒体标记物和所有来自a、b的命中率的分布。（e） HeLa细胞表达内源性TVP23B和GM130染色的golgin-mito (HA)的图谱。（f） LOPIT-DC中使用的Flp-In 293细胞的显微镜定量(补充图2b)，显示线粒体上的TVP23B强度与高尔基体上的强度之比(MitoRatio)。
3. golgin-97特异性囊泡的衔接蛋白和辅助因子
高尔基体转运牵引中TBC1D23和WDR11复合物的发现是通过golgin-97-mito捕获的囊泡的邻近生物素化实现的，这表明golgin-97-mito定位到线粒体的外周膜蛋白可能是参与转运牵引过程的衔接蛋白和辅助因子，有51个外周膜蛋白在内质体网络中的定位受golgin-97-mito（图3a，b）的影响，包括VPS45，一种参与内质体与高尔基体囊泡与TGN融合的SM（Sec1p/Munc18）蛋白。我们还发现来自多种内体分类途径的衔接蛋白和辅助因子富集，包括AP-1衔接蛋白（AP1G1、AP1S2、AP1AR、AP1M1和AP1S1）和辅助蛋白（CLINT1、SYNRG、PI4K2B和Rab9），但不包括其相关的网格蛋白外壳。我们还发现了参与逆转录酶依赖性转运的蛋白（SNX3、SNX4、VPS35、VPS26、VPS29），以及可能参与逆转录酶依赖性转运的SNX-BAR蛋白（SNX1、SNX2、SNX5和SNX6）。许多外周膜蛋白定位于细胞中的多个隔间，使得它们难以通过空间蛋白质组学进行分类（图3c）；然而，我们清楚地观察到golgin-97-mito诱导这些蛋白质向更具线粒体特征的方向移动（图3c-f）。与TBC1D23一样，我们预计这些外周膜蛋白的线粒体越多，它们直接与golgin-9714结合的可能性就越大，SPRYD7是一种功能未知的蛋白质的例子，其内源性定位于囊泡并符合这一标准（图1e、3a）。
另一种解释是，golgin-97-mito向线粒体募集内质体或TGN衍生的囊泡。溶酶体水解酶是顺行运输的关键标志物，通过TGN和内质体进入溶酶体。在我们的分析中，我们没有观察到golgin-97-mito使溶酶体水解酶明显转移到线粒体的现象（补充图3）；同样，内质体标记EEA1和Rab5没有显示出可检测到的线粒体部分的转移（补充数据2）。我们还对表达golgin-97-mito的细胞进行了相关光和电子断层扫描（CLEM），发现线粒体周围聚集了直径约为30至80 nm的球形和椭圆形结构，这与预测的运输囊泡大小相关（图4a-e）。总之，这些数据表明golgin-97-mito能够捕获由AP-1、SNX3、SNX4和SNX-BAR蛋白形成的逆行运输载体的模型。研究还表明，当高尔基体运输到TGN时，一部分衔接蛋白仍然存在于高尔基体载体的内体上。
图3 golgin-97特异性囊泡的衔接蛋白和辅助因子
(a)对mito与golgin-97-mito的MitoRatio与Bayes因子分析显示，所有命中（蓝色）均定位于内质体网络并且也是可溶性蛋白质（如图2a所示）。(b)所有点击按从左栏到右栏的顺序显示，以MitoRatio分数递减为基础。(c) mito的LOPIT-DC与golgin-97-mito的PCA投影，显示SVM分类和根据分类途径染色的指示蛋白质。(d–f) TMT报告子：每个复制的线粒体与golgin-97-mito的蛋白质在各个部分的离子分布，显示已知线粒体标记物（线粒体）的轮廓和所有来自a、b的点击属于指定的分类途径。
4. 线粒体golgins改变过氧化物酶体的方向
大量囊泡异位转运在golgin包被的线粒体上可能对细胞的其他部分产生一些间接影响，这一点在电子显微镜下可以通过线粒体的形态变化得到证实，因为它们被囊泡越来越多地压缩在一起。我们总共检测到43种受golgin-97-mito影响的蛋白质，它们与内质体网络无关（补充图4a，b），其中34个是过氧化物酶体蛋白，它们被golgin-97-mito和GCC88-mito转移到更具线粒体的位置（补充图4c）。这种转变的程度在前者更为明显，这与其更强的捕获囊泡的整体能力有关（图1g），而与此相一致的是，我们通过免疫荧光检测发现，在存在golgin -97-mito的情况下，过氧化物酶体与线粒体相邻，而在存在BioIDmito对照的情况下则没有（补充图4d）。其原因尚不清楚，但过氧化物酶体和线粒体在脂肪酸的β-氧化和活性氧的解毒中具有共同依赖关系；此外，有证据表明过氧化物酶体与线粒体接触，特别是在线粒体内质网连接处，在酵母和哺乳动物细胞中已有报道。我们的LOPIT-DC数据可能提供了这种相互依赖性的进一步证据，但不管是什么原因，它都证明了LOPIT-DC耦合贝叶斯分析方法的整体能力和敏感性。
图4 golgin-97-mito捕获小泡的电子断层扫描
(a)表达golgin-97-mito和TMEM87A-RFP的Lowicryl包埋HeLa细胞的CLEM，整个厚度约为350 nm。(b–d)通过使用LimeSeg进行三维分割，显示a中球形结构的定量箱形图。(e)在b-d中显示的定量结构的三维投影。
5. GCC88和golgin-97共享一个不同的富含TMEM87A和TGN46的囊泡
在16个受GCC88-mito影响最大的总蛋白中，TMEM87A和TGN46的定位变化最大（图1f）。TMEM87A是GPCR相关蛋白LU7TM家族的一员，该家族参与了内质体到高尔基体的逆行运输，并定位于TGN。TGN46和TMEM87A在对照细胞中具有几乎相同的轮廓，并且都被GCC88-mito明显地移向线粒体（图5a-c）。与TGN46一样，TMEM87A也通过golgin-97-mito重新定位到线粒体（图。5b、c、2b）；此外，TMEM87A-RFP定位于直径约50 nm的球形结构，通过golgin-97-mito与线粒体相连，并用CLEM分析（图。4b–d，5d）。如上所述，一些由golgin-97重新定位的货物蛋白不能被GCC88捕获，因此TMEM87A必须富集在一类独特的逆行运输囊泡中。
IGF2R和M6PR从内质体向高尔基体的逆行运输涉及到网格蛋白/AP-1、逆转录酶依赖和独立的通路；然而，GCC88-mito的LOPIT-DC都没有检测到这两种物质的影响（图5b），这表明GCC88捕获的富含TMEM87A和TGN46的的囊泡并不依赖于这些特殊的逆行途径。GCC88-mito细胞在瞬时转染表达时可捕获富含IGF2R和M6PR的囊泡。在LOPIT-DC实验中，GCC88-mito表达水平较低且稳定，这可能使我们只能检测到明显的囊泡池。
图5 GCC88和golgin-97共享一个独特的富含TMEM87A和TGN46的囊泡池
(a) mito的LOPIT-DC与GCC88mito的PCA投影，显示SVM分类和定位于内质体网络的前六个点击，如图1f所示。(b) TMT报告子：mito的每个复制的各个部分的蛋白质离子分布，golgin-97-mito和GCC88-mito显示了已知线粒体标记物（线粒体）和指示蛋白质的图谱。(c)表达BioID-mito的HeLa细胞和被内源性TMEM87A (cargo)染色的golgin-mito (HA)的共聚焦显微照片。
TGN46先前已被证明依赖于golgin-97、golgin-245和TBC1D23进行高尔基体积累。为了将这项研究扩展到GCC88，我们使用CRISPRCas9产生了ΔGCC88突变体（图6a）。当TGN46从内质体错误分类时，它被转移到溶酶体并降解，使得其分类的效力可以通过免疫荧光和印迹法进行量化，但是我们通过印迹法仅观察到Δgcc88突变体中TGN46水平的轻微降低（图6a），而通过免疫荧光法，TMEM87A定位于TGN在Δtbc1d23突变体和Δgolgin-97/Δgolgin-245突变体中变得更加分散，但Δgcc88突变体没有显著影响（图6b，c）。总之，这些结果表明golgin-97和golgin-245也通过TBC1D23招募富含TMEM87A和TGN46的囊泡，并且比GCC88更有效地捕获这些囊泡。尽管如此，GCC88仍然能够捕获一组含有TMEM87A和TGN46的囊泡，但不能捕获大量的逆行物质，如甘露糖6-磷酸受体。我们的结果还表明，GCC88与golgin-97和golgin-245在捕获某些囊泡池方面是多余的。为了支持这一点，Δgolgin-97/Δgolgin-245突变体中GCC88的敲除阻止了细胞生长（图6d）。
图6 GCC88和golgin-97/golgin-245具有共同支持细胞活力的冗余作用
(a)用抗体检测野生型和突变型HeLa细胞蛋白质的免疫印迹。(b)内源性TMEM87A（cargo）、GM130（顺式高尔基体标记物）和DAPI染色的野生型和突变HeLa细胞的共聚焦显微照片。(c)测量高尔基体上TMEM87A强度与GM130强度之比的定量。(d)敲除GCC88对Δgolgin-97/Δgolgin-245双敲除HeLa细胞生长的影响。
结论
总之，我们阐明了结合囊泡再定位和高分辨率空间蛋白质组学作为表征细胞内转运囊泡含量方法的有效性。我们的研究提供了大量沿逆行路线移动的转运蛋白，以及可能作用于这些转运蛋白的外周膜蛋白，这有望为进一步研究细胞内膜运输提供有价值的资源。我们已经确认了四个之前没有报道的被线粒体golgins捕获的货物（ATG9A、TVP23B、furin和TMEM87A）。尽管如此，需要指出的是，我们使用了一个经验截止点来选择一组得分较高的数据进行进一步分析，并且，就像任何统计截止点一样，它在某种程度上是武断的。因此，其他一些撞击可能不在囊泡中，而一些低于临界点的撞击，特别是接近边界的撞击，可能实际上在囊泡中。最后，这种方法并不局限于运输小泡，也可以应用于任何蛋白质复合物或亚细胞隔间，与常驻蛋白可以迁移到异位位置。因此，我们提出了一个通用的策略来定义细胞内的亚蛋白质组在其自然的细胞环境。