文章信息

文章题目：Single-cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression
期刊：Nature Cell Biology
日期：2021年1月8号
DOI: https://doi.org/10.1038/s41556-020-00613-6

背景知识

前列腺癌仍然是全世界最普遍的男性恶性肿瘤。惰性患者可以存活数年而无进展，而侵袭性患者可能迅速转移并变得无法治愈。尽管近年来总体上前列腺癌的发病率有所下降，但同时观察到晚期或转移性前列腺癌患者稳步增加，主张改善治疗策略。因此，迫切需要进一步了解前列腺癌的异质性。以前的研究是基于批量测序的，它代表了来自肿瘤和微环境（TME）的信号集体平均反映，可能忽略了可能推动疾病发展的特异细胞群。单细胞RNA测序可以解开细胞建立协通信互作网络和了解不同肿瘤以及TME关键进化成分。

在本文中，作者们对13个样本的前列腺肿瘤进行了scRNA-seq测序，获得了36,424个细胞的转录组谱。还收集并分析了另外14个样本，包括正常前列腺组织，NCCN（国家综合癌症网络）低/高风险和去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。总共分析了来自27个组织样本的111,914个单细胞。

研究思路

研究结果

1.前列腺癌的单细胞景观

13个前列腺肿瘤的36,424个单细胞的转录组，首先分为了7个细胞群（fig 1 a），各细胞群的marker 如 fig1b。通常，TME细胞簇只包含归类为非恶性的细胞，管腔细胞群（图1a）包含混合的细胞，大多数被归类为恶性，还有一些细胞类型尚未确定，反映了亚克隆多样性。基底/中间细胞簇主要包含分类为非恶性和未分辨的细胞。与上皮细胞（图1c）相比，TME成分（非上皮细胞）显示出较低的表达复杂性，与先前的研究一致。尽管推断管腔细胞群的CNA偏差明显更高其余区域（Mann–Whitney U检验，P <2.2×10 -16，公共语言效果大小（CLES）= 0.97其它单个细胞群值范围很广（0-0.47））（图1d），然而值得注意的是非恶性上皮细胞也可能有助于腔细胞的CNA谱。

单个样本的肿瘤细胞类型组成存在显着差异（图1e）。如预期的那样，腔管是大多数肿瘤的主要上皮类型（图1e和图2b的扩展数据）。然而，基底/中间细胞是样品154的主要上皮细胞类型（基底/中间体：管腔＝ 7；图1e）。

使用先前PAM50基因签名将前列腺癌分为腔A，腔B和基底亚型，并且能够告知疾病结局。但是，PAM50基因签名是为乳腺癌创建的，可能无法完全代表前列腺癌。此外，在分析数据中，对于非上皮细胞观察到了PAM50基因签名高表达信号，表明基因签名存在基质细胞信号的污染。同样，从先前的显微解剖分析得出相关基因签名的格里森评分（GS）在基质细胞中最高，在TME细胞中优先表达了19个基因签名中的3个。考虑到基质细胞基因表达成分可能对bulk测序衍生的特征有着显着贡献，所有重要的是要独立评估不同的细胞类型。因此，作者接下来试图解剖潜在的肿瘤侵袭性上皮细胞亚群，并创建前列腺癌的纯化基因签名。

2.上皮细胞亚群分析

重新分析上皮细胞，包括基底/中间和管腔细胞，产生16个细胞亚群（图2a）。大多数簇由多名患者的细胞组成，表明细胞亚群无偏见。为了确定与临床表型差异相关的细胞亚群，作者跨簇比较了的多个与前列腺癌亚型相关的信号表达。除了10和12细胞群外，PAM50分类的管腔A和B信号同时在大多数细胞群显示高信号。然而10细胞群高表达管腔A具有的信号，而12细胞群富集管腔B特征，表明这官腔A和B特征分别由这两个细胞群具体确定。12细胞群还具有最高分数的缺氧信号和PCS1，PCS1是与前列腺癌转移相关的腔亚型。考虑到所有四个签名基因均具有重要的临床关联性，群10和12是与前列腺癌进展相关的潜在关键细胞亚群。因此，接下来导出代表这二个亚群的基因签名。细胞群10高表达基底/中间细胞的特异性标记基因（KRT5，KRT14，KRT19和TP63；图2b），被称为“基底/中间细胞”。细胞群12的标记基因，包括已知的细胞周期相关基因CDC20，CCNB1，CENPF和PTTG1，富集在细胞分裂有关的术语，表明细胞周期调控的差异。使用cyclone为细胞分配到其细胞周期。群12显示显着富集到G2 / M细胞周期（Fisher's精确检验，P = 6.7×10 -41，比值比（OR）= 5.7），表示受细胞周期相关驱动的细胞群，因此被称为“ CellCycle”。与其管腔细胞相比，CellCycle和基底/中间细胞显示出独特的细胞功能（图2c）。CellCycle细胞群具有丰富的功能，例如氧化磷酸化和DNA复制，而却缺乏普通的管腔细胞功能。基底/中间细胞特别与抗原加工和呈递有关（图2c）。

与先前的研究一致，CellCycle可预测人群的疾病预后 (图2d)。这与观察到细胞周期的细胞是一致的，它显示管腔B，缺氧和PCS1签名的高表，这三种特征与不利的结果相关联。显示三种高风险融合特征CellCycle细胞群代表从Bulk数据中识别的不同高风险亚型的共同亚群。尽管如此细胞循环状态是否是细胞群的主要驱动力尚待确定。

管腔A指示无复发生存期更长，较高的基底/中间细胞签名信号与更好的生存期相关（图2e）。由于基底/中间细胞显示出高表达抗原加工和呈递的基因（图2c），因此作者研究了与免疫调节相关的基因。HLA II类和趋化因子基因CCL2均在基底/中间细胞中特异性表达（图2b）。值得注意的是，基底/中间细胞是表达CCL2的主要细胞群（图2f，g），在两个具有最低基底/中间细胞含量的样品中，CCL2未检测到表达式。

CCL2的表达也与Bulk测序数据中基底/中间细胞的含量显着相关（图2h）。去除浸润的基质细胞对CCL2 的影响后，这种高度相关性仍然存在。考虑到CCL2是一种吸引趋化因子的趋化因子，其吸引了包括巨噬细胞和T细胞在内的免疫细胞，因此研究了作者研究基底/中间细胞含量与巨噬细胞以及浸润T细胞之间的关系。正如预期的那样，在多个队列中观察到了很强的相关性（图2i）。总之，这些结果表明基底/中间细胞吸引了免疫细胞，这可能有助于理解基底/中间细胞评分高患者的良好预后。

3 单核细胞和肥大细胞亚群分群: 肿瘤相关的巨噬细胞显示出破骨细胞样特征

确定了两个不同的髓系种群-单核细胞和肥大细胞（图1a）。为了进一步表征它们（图3a），将它们的平均丰度与分类Bulk细胞总体概况进行了比较，并检查了标记基因的表达。细胞群1显示出与髓样树突状细胞的最高相关性，而其他与单核细胞的相关性最高（图3b）。它们都显示高水平的HLA-DRA和CD68，并且所有单核细胞而非树突状细胞均显示高水平的CD14和FCGR3A（图3c）。此外，C1q蛋白家族基因和MSR1（CD204）在0、2、4、5和6群高，显示出巨噬细胞的特征。所有细胞分为三种亚型：单核细胞，树突状细胞（DC）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）（图3a）。

已经报道过两种主要类型的巨噬细胞激活，即经典（M1）和变异（M2）类型，其中M2主要被认为具有促癌作用。观察到TAM之间存在M1和M2信号混合激活（图3c），两个信号之间具有很强的正相关关系（图3d），这与最近在人类癌症中的研究表明TAM共表达M1和M2一致。然而，TAM簇之间存在显着的异质性，并且参与巨噬细胞功能和激活的重要途径，包括肿瘤坏死因子（TNF），核因子（NF）-κB，核苷酸寡聚域和Toll样受体信号传导，这些途径受到不同的调控（图3e）。

细胞群6表现出更高的破骨细胞（OC）相关途径（如矿物质吸收和溶酶体）的激活。这很有趣，因为骨骼是前列腺癌最常见的转移部位之一，而OCs参与了这一过程。单核细胞/巨噬细胞谱系分化为OCs与活性配体-受体相互作用有关，因此作者使用CellPhoneDB进行了细胞通讯分析。他们专注于细胞群6特有的交互作用，发现它们主要与OC调节有关。在独特的受体配体对中， CDH1编码的E-钙粘着蛋白被报道是破骨细胞生成的重要调节剂。激活素（INHBA / INHBB）和它们的受体（ACVR1B / ACVR2A）参与调节OC调节，包括增强RANKL介导的分化，这是一个主要途径诱导巨噬细胞成为OC。OC抑制作用已被证明可以延迟前列腺癌的骨转移。实际上，在所有样品中都可检测到TAM中 C6细胞群，表明TME建立的早期就有助于肿瘤扩散。

接下来，在亚分群中，注重找到关注的研究重点，并且引入了公共数据分析、实验分析、临床样本深入分析、以及加入新临床样本分析来对单细胞群分析结果的支持。

4 T 细胞亚群分析: 浸润的CD8+效应T细胞表达肿瘤标志物基因

根据标记基因的表达，将T细胞亚型分为CD4+T传统型（Tconv），CD4+T调节型（Treg），CD8+T初始和CD8+T效应细胞（图3f，g）。在T reg细胞中观察到脂质和氨基酸代谢降低，且糖酵解水平增加，这与先前对FOXP3阳性胸腺来源的Treg细胞的研究一致。有趣的是，由CD8+T效应细胞组成的三个簇（2、3和5）表现出明显的异质性。5细胞群是活化最少的亚型，具有大多数代谢和免疫途径的最低水平，而细胞群3显示了高度活化的T细胞的特征（图3h）。令人惊讶的是，在3和5以及Treg细胞中发现了高水平的KLK3（编码前列腺特异性抗原（PSA）的基因）。为了了解这种意外的KLK3表达的潜在机制，作者们进行了基因共表达分析，以鉴定高度相关的基因模块，并专注于显示亚型或细胞群特异性激活的模块。

对特定于亚型的模块分析显示显著富集的术语与它们各自功能相关（图3h）。有趣的是，一半以上的亚型特异性模块是Treg特有的，这表明与其他T细胞亚型相比，Treg的转录组程序不同。Treg特定模块的富集术语包括沿袭调节过程，如淋巴样祖细胞分化，调节性T细胞分化和各种碳水化合物和氨基酸底物的代谢，还有先前报道的涉及Foxp3和Treg调节的途径有关的术语，例如Wnt蛋白和RAGE受体。由整联蛋白介导的细胞粘附也被富集到Treg。由于整联蛋白在T细胞上的表达会影响免疫浸润，因此这种富集表明Treg归巢到肿瘤区域的可能机制。

模块61在T细胞簇中是唯一KLK3高的，其梯度激活对应于KLK3丰度（图3h）。值得注意的是，该模块中的统计丰富术语与细胞外囊泡（EV）和外泌体有关（图3h）。此外，其他雄激素受体（AR）签名基因大多未表达，表明KLK3丰度可能是外源性的，而不是T细胞中AR信号的激活。因此，作者假设CD8+T细胞中肿瘤特异性基因表达的积累是由肿瘤衍生的EV介导的。作者在所有T细胞亚组中检测到KLK3表达，提示EV的作用可能伴随着肿瘤浸润T细胞的不同阶段（图3h）。

1）公共数据验证：T细胞中上皮的肿瘤标志物的积累在其它癌症中也存在

接下来，作者分析T细胞中上皮的肿瘤标志物的积累是否仅限于前列腺癌。分析了四种其他癌症类型（方法）的公共scRNA-seq数据：头颈部鳞状细胞癌（HNSCC），非小细胞肺癌（NSCLC），结肠直肠癌（CRC）和肝细胞癌（HCC）。在所有四种癌症类型T细胞中都确定了上皮肿瘤标志物肿瘤标记基因在T细胞中的表达（图4a），这表明这可能是浸润T细胞转录的一般特征。

2）实验验证：前列腺癌细胞的EVs诱导T细胞中_KLK3_表达

验证来自患者样品的浸润T细胞中肿瘤标志物基因的存在和来源。所述KLK3阳性T细胞特异性模块含有其它特定前列腺癌基因，包括FOLH1，其编码前列腺特异性膜抗原（PSMA）。使用流式细胞仪从肿瘤组织中分离出PSMA阳性T细胞。实时定量聚合酶链反应与逆转录（rtPCR）分析显示，PSMA阳性但非阴性T细胞中KLK3含量很高（图4b），证实了T细胞中肿瘤标志物基因的存在。

为了测试肿瘤细胞改变T细胞基因表达谱的能力，培养了从健康供体分选的T细胞和两种前列腺癌细胞系，并检查了KLK3在T细胞中的丰度。24小时后细胞。与AR阳性的C4-2B而非AR阴性的DU145细胞系共培养导致T细胞中KLK3表达的显着增加（图4c）。此外，通过rtPCR和RNA荧光原位杂交确定，从C4-2B中分离出含EV的沉淀物，但未从DU145细胞培养上清液中分离出，同时检测到T细胞中的KLK3（RNA-FISH;图4d ，e）。此外，免疫荧光染色揭示了PSA在CD8+T细胞中的定位，该CD8+T细胞与来自C4-2B的EV共培养，而不是DU145细胞。含EV沉淀的不连续超速离心碘克沙醇梯度显示，KLK3 RNA和蛋白质主要存在于囊泡中，但不存在于不含EV的馏分中。综上所述，这些数据表明，前列腺癌细胞分泌的EVs可以改变浸润性T细胞的转录组。

3）临床样本深入解析验证

作者观察到肿瘤来源的EVs可以直接改变局部肿瘤中T细胞mRNA和蛋白质丰度（图4d，e），所以接下来询问EVs是否以及在多大程度上影响附近的淋巴结（LNs）。从NCCN高危患者中收集接受前列腺癌根治术的原发性前列腺肿瘤和盆腔淋巴结清扫术的两个外闭孔LN样本。它们共振成像（MRI）和组织病理学分析均未显示LNs有转移（图4f）。

有趣的是，尽管没有通过成像或病理检查发现可观察到的转移（图4f），但在左侧LN中发现了少量上皮细胞（图4g）。CNA推论分析表明，上皮细胞的一个子集（84/153）带有与平均肿瘤CNA谱一致的CNA，强烈暗示左LN中有淋巴微转移（图4h）。观察到在所有细胞类型中KLK3表达，其中左侧（而非右侧）淋巴样中的T细胞数量最多（1,209）（图4i）。与EV介导的表达相一致，T细胞和其余TME中的KLK3的丰度远低于上皮细胞。在未观察到微转移的正确LN样本中，检测到2个T细胞和1个B细胞的KLK3表达。这表明LNs中免疫细胞基因表达的改变可能在发生在实际转移之前，从而潜在地建立了转移前的微环境。

5 成纤维细胞的亚群分析: TME中与癌症相关的成纤维细胞的异质性

越来越多的证据表明，癌症相关的成纤维细胞（CAF）在前列腺癌的进展中起着重要的作用，作者鉴定出948个成纤维细胞（图5a），根据每个簇之间的相似性和关键标记基因的表达，将五个不同的簇分为三个亚型（图5a，b）。

大多数标记物在三种亚型中显示出独特的表达模式，只有一般的间充质基因VIM显示出高而普遍的信号（图5b）。尽管ACTA2及其蛋白产物α-肌动蛋白是其他癌症类型中常见的CAF标志物，但前列腺癌的免疫组织化学染色显示表达减少。这里的ACTA2在CAF子集中显示的量与VIM相当，并且信号与其他标记物共表达。在先前的研究中ACTA2耗尽表达可能来自在基质组合物中的变化，如ACTA2CAF细胞群在ACTA2EC中增加或扩增。此外，一个积极的趋势，虽然 ACTA2CAF的百分比和上皮细胞的上皮至间质（EMT）转变分数不显著（斯皮尔曼的ρ = 0.38，P = 0.202,但表明EMT是ACTA2CAF的可能来源。总之，这些差异凸显了TME的复杂性以及在较大的患者队列中对单细胞水平分析的需求。

对每种CAF亚型的前150个上调基因进行了基因富集分析。毫不奇怪，与血管生成相关的基因在所有亚型中均富集（图5c），而与肌纤维母细胞，细胞粘附和细胞外基质（ECM）相关的富集基因（图5c）更具亚型特异性。转录因子（TF）分析显示S2最丰富的TF是CREB3L1和PLAGL1，它们控制ECM生成和消耗，这表明ECM活化CAF分化的一个重要方面。HOXB2S3中的MAFB和MAFB在S3具有最高激活，而S1中的ETS1则稍高。有趣的是，MAFB抑制由ETS1介导的髓系谱系基因的转录。这类似于在病理条件下将骨髓细胞转分化为成纤维样细胞。尽管需要更多的工作来说明前列腺癌中肌成纤维细胞CAF的实际来源，这些数据为CAF和TME中非成纤维细胞谱系之间共享的调控网络提供了证据。

6 内皮细胞分群：激活的ECs修饰肿瘤细胞外基质

检测到3,115个EC，这些ECs进一步分为六个子类（图5d）。观察到了内皮标记基因PECAM1的普遍表达。FLT1的存在和PDPN表达的缺失表明ECs来自血管而不是淋巴管（图5e）。有趣的是，观察到与激活的CAF相关的基因在EC亚群中高度表达（图5e）。具体来说，细胞群2表达S100A4，一种转移相关基因，以前曾报道可促进肿瘤血管生成。群3和4对THY1呈阳性，在微血管内皮细胞上的表达促进黑色素瘤转移。群5具有高丰度的THY1，ACTA2和S100A4，显示出高度类似于CAF的特征。一起将这四个表达CAF标记的EC细胞群命名为aEC。

使用Monocle对aEC进行的伪时间分析显示，有两个分支的细胞命运，从群0和1开始，一端朝着的群3和4延伸，另一端朝着的群5延伸，群2为过渡状态沿链扩展（图5f）。实际上，差异表达基因分析将六个簇归因于与伪时间状态一致的四个亚型（图5g）。对差异表达基因的更详细检查显示，传统EC和aEC之间的配体和受体显著失调。接下来用CellphoneDB 研究了细胞之间的相互作用。值得注意的是，aEC具有与上皮细胞的更高数量的相互作用（图5h）。另外，aEC具有来自EC和成纤维细胞的大部分交互作用（图5i）。在aEC中，独特是BMP2和I / II型BMP受体（BMPR1A，BMPR2）之间的相互作用，它们会诱导人EC中的迁移和侵袭（图5j）。相比之下，EC特异性相互作用富集趋化因子，包括CCL3，CCL5，CCL18和CCL23。免疫激活相关基因，例如CCL2和BIRC3在传统EC中的丰度较低，这与先前的发现一致（与肿瘤相关的ECs下调免疫吸引途径）。

EC集群之间的通路激活比较进一步支持了分析。在群0和1的顶部富集途径大多是免疫相关，尽而在aECs最常见的途径是ECM-受体信号传导和粘着斑（图5K）。总之，这些数据表明，aECs在进一步下调免疫激活的同时修饰了ECM。

1 新数据集验证分析：CRPC富含aECs并促进癌细胞侵袭

鉴于aECs具有转移相关信号，并且癌细胞可以诱导ECM重塑以促进疾病扩散，假设aECs与更具侵略性的前列腺癌相关。对膀胱癌根治性切除术中获得的六个前列腺组织和CRPC患者的五个肿瘤进行了scRNA-seq（图6a，b 1）。这些样本捕获了前列腺生活史中的不同元素，并作为对照。为了更好地表示前列腺的空间异质性，收集了每个前列腺左、右、外周区的样品并分别进行了测序。在正常CRPC队列中检测到类似于aECs群的THY1阳性子集（图6c）。令人惊讶的是，两个aECs群（0和1）主要由来自CRPC样本的细胞组成（图6d）。伪时间分析揭示了从传统EC到aECs的进展，这与群中CRPC细胞百分比的增加高度相关（ρ = 0.95，P = 0.001）。在aECs亚群中也观察到了ECM-受体相互作用和粘着途径的激活（图6e）。

2 临床样本验证分析

试图验证新鲜人肿瘤样品中aECs与CRPC的关联。收集了膀胱癌患者的原发性前列腺癌（ADPC）、CRPC样本以及正常前列腺组织（每种情况n = 4）。通过使用CD31（PECAM1，内皮细胞标记）和CD90（THY1，CAF细胞标记）抗体的流式细胞术分离aECs。与分析一致，与正常前列腺样品相比，从CRPC中分离出的aECs比例比从ADPC中分离的要高得多（图6f，g；Student's test ，分别为P = 0.001和0.033）。为了了解aECs对癌细胞的影响，使用CD31+进行了共培养实验/ CD90+aECs群，然后检查细胞侵袭。如所预期的，在aECs共培养条件下观察到侵袭显着增加（Student's test，P＝ 0.025）（图6h）

总结

分析了来自13个前列腺肿瘤的36,424个单细胞的转录组，并确定了揭示疾病侵袭性的上皮细胞；肿瘤微环境（TME）显示了多个与进展相关的转录程序激活；
观察到KLK3混杂表达，验证了癌细胞改变T细胞转录表达的能力，对原发肿瘤和两个匹配的淋巴结进行分析表明KLK3异位表达与微转移有关；
一个内皮细胞亚群与肿瘤细胞沟通活跃（激活的内皮细胞，aECs），通过加入额外的11个样本数据分析显示aECs在去势抵抗性前列腺癌中富含并促进癌细胞侵袭；
构建了一个用户友好的Web界面，供用户浏览探索数据。

单细胞揭示不同类型转录重构助力人类前列腺癌研究进展