乳腺肿瘤微环境中具有多种免疫表型的单细胞图谱
不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了，很幸运聚集了一些小伙伴携手共进，我们承诺不间断更新5个月，把我们这两年的学习成果全部掏出来给大家，包括5个栏目：
文献速递（简短介绍，扩充知识面）
文献详解（图文并茂带来大家系统性学习）
R与Bioconductor的技巧（书籍翻译，妙招共享）
scRNAseq的GitHub的书籍翻译（原汁原味的名校教程）
全网第一个单细胞转录组视频教程学习笔记分享
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希望大家能有所收获！
总览
对肿瘤微环境中免疫细胞表型的了解对于理解癌症进展和免疫治疗反应的机制是必不可少的。 这项研究使用单细胞RNA-seq技术分析了来自8个乳腺癌的45,000多个免疫细胞，以及匹配的正常乳腺组织，血液和淋巴结，展示了正常和肿瘤组织驻留免疫细胞之间具有显著相似性的全面的免疫图谱，并观察到肿瘤微环境特有的连续表型扩增特性。对来自27,000个另外的单细胞（T细胞）RNA及对应的T细胞受体（TCR）测序数据的分析结果，揭示了TCR对表型多样性的联合性影响。结果支持T细胞连续激活的模型，这篇文章的研究结果对于表征肿瘤浸润性免疫细胞的特性具有重要意义。
样本
8个原发性乳腺癌女性患者的病灶组织样本、正常组织样本以及血液和淋巴结样本。
主要技术
1.inDrop (Klein et al., 2015; Zilionis et al., 2017) 基于微滴的单细胞RNA测序技术
inDrop技术：利用微流体装置将带有条形码的微珠和细胞一起装入微小的液滴。这些液滴在一个小型设备上生成，沿着一根头发宽的槽道流动。条形码附着到每个细胞的一些基因上，因此可以一次测序所有的基因，追踪每个基因的来源细胞。
本文对该技术进行改良，增加了通量。
2.10x测序技术（ 5'端及VDJ建库）
流式分选了大约12000个CD3+免疫细胞，细胞浓度700个/ul。5'端转录组用Illumina NextSeq platform测序，VDJ region-enriched libraries 用Illumina HiSeq 2500 测序。
3.CyTOF流式质谱技术
质谱流式细胞技术（Mass Cytometry）是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力。该技术使用金属元素做为流式抗体、染料的标志物，利用质谱对标记细胞进行定量检测。这一技术的优势一是使流式检测通道数量大幅提高到了上百个，提升了从单个样品获得的信息量；二是避免了通道间信号的干扰。信号分子检测数量的增加意味着对细胞群内的表型进行更精准的观察和分类，意味着对细胞株的均一性有更准确的认识，也意味着对细胞内信号转导网络有更清晰的了解；同时它也为单细胞蛋白质组的发展提供了新的研究手段。
整体流程
数据处理
1
indrop数据
作者使用序列质量控制（SEQC）包来过滤错误和偏差，最后生成矩阵，输入文件是Illumina fastq或bcl文件。作者将SEQC开发成适用于单细胞测序结果，SEQC是模块化的，也能处理inDrop，drop-seq，10X和Mars-Seq2结果。
过滤后的reads用STAR(Dobin et al., 2013)做比对。作者还做了细胞barcode矫正、UMI验证。用GENDODE基因组和GTF文件构建了一个自定义注释。用Biscuit聚类。
2
10x数据
用Cell Ranger 2.1.1分析，用Loupe Cell查看。最终获得27075个T细胞。用Biscuit聚类。与indrop数据相比，该方法捕获率增加。通过取T细胞活化特征中所有基因的平均表达来计算每个T细胞的活化状态。
结果
1
组织微环境影响了免疫表型状态的多样性
从8个患者中收集到47016个CD45+细胞。作者使用t-SNE降维来观察组织之间的表型重叠，可以看出，血液和淋巴结中的T细胞表型与乳房组织中的T细胞不同。虽然T和髓系细胞在肿瘤和正常组织样品之间有大部分重叠，但肿瘤中细胞表型异质性和细胞群体数目增加了。看饼图可以发现，naive T细胞在具有血液特性的三个群体中明显富集，而B细胞在淋巴结中比在其他组织中更普遍。T细胞亚群在肿瘤和正常组织中都存在，但细胞毒性T细胞群在肿瘤中更富集，Treg群也是如此。此外，一些骨髓细胞群在正常组织和肿瘤组织之间共享，而激活的巨噬细胞群有肿瘤特异性（肿瘤相关巨噬细胞或TAMs）。
2
免疫细胞在肿瘤微环境中发现表型增多
作者观察到大量正常乳腺组织驻留免疫细胞的状态，包括在循环或次级淋巴组织中未观察到的13个骨髓和19个T细胞群体。此外，在正常乳腺组织细胞中发现了一个细胞群体，是肿瘤中观察到的那些群体的子集，只在肿瘤中出现的有14个骨髓和17个T细胞群体，这相比于正常组织观察到的细胞群体数增加了一倍。 相反，正常组织没有发现特异性细胞群。
表格是GSEA结果，与正常组织相比，肿瘤中基因表达的变化程度显着增加。作者发现变化幅度增加最大的基因富含肿瘤环境中激活的信号通路，包括I型（IFNa）和II型干扰素（IFNg），肿瘤坏死因子α（TNF-α），转化生长因子b（ TGF-β），IL6 / JAK / STAT信号传导和缺氧（STAR方法）。
为了进一步探索这种变化，作者定义了一个度量：表型容量。具体而言，该度量使用基因表达中的协方差来测量由独立表型跨越的体积（STAR方法）。用这种度量，作者比较了正常组织与肿瘤组织中每种细胞类型所占的表型容量。 结果显示，与正常乳腺组织相比，肿瘤中所有主要细胞类型（包括T细胞，骨髓细胞和NK细胞）的表型容量显着增加。
3
肿瘤内驻留T细胞的连续组分变化
作者使用了这种扩散图来表征表型变化的最重要来源。分别分析T细胞和骨髓细胞，以避免细胞类型特异性捕获率的偏差。大部分T细胞组分能够定义渐变的变化趋势。前3个最具信息性的组分分别与激活，终末分化和缺氧的特征相关。将最具信息的组分标记为“激活”，其与T细胞活化和进行性分化的基因特征以及IFNg信号传导高度相关（STAR方法）。激活特征的平均表达沿着组分稳定增加，伴随着特定激活相关基因表达的逐渐增加。
4
单细胞RNA和TCR测序联合结果揭示了个体T细胞克隆型的激活状态范围
T细胞激活轨迹再现了连续梯度，为了评估TCR多样性解释这种连续性的程度，作者使用单细胞RNA和TCR测序联合数据分别绘制了每种克隆型的激活状态。TCR克隆型共同分析的表达变异发现每个簇实际上由克隆型的不同组合子集组成，并且每个克隆型仅存在于少数相关细胞群中。然而，在每个单独的克隆型中存在宽范围的活化状态。有趣的是，当与TCR克隆型共同分析时，可以观察到每个细胞群体实际上由克隆型的不同组合子集组成。
总结
尽管癌症免疫疗法取得了重大进展，但是由于肿瘤内免疫细胞的异质性，人们对机制或预测疗效不能充分了解。本文采用了无偏的单细胞RNA-seq分析手段，结合从正常和癌性乳腺组织分离的免疫细胞，以及外周血和淋巴结中免疫细胞，在乳腺癌中构建免疫图谱。该图谱揭示了适应性和先天免疫系统的免疫细胞之间的巨大差异。癌症免疫疗法有两个2个主要细胞靶标：T细胞和骨髓细胞。文章的发现以及由此产生的广泛的免疫单细胞RNA和TCR-seq数据集以及开发的综合分析平台将有助于更好地理解免疫细胞以及理解肿瘤发展的潜在机制。