熏蒸+有机改良剂，防治番茄枯萎病的有效新策略

近期，派森诺与南京农业大学合作在《npj Biofilms and Microbiomes》发表研究论文，以土壤菌群为实验对象，研究了使用土壤熏蒸模拟干扰后施用生物有机和有机改良剂，并利用高通量测序技术，探究其如何通过重塑土壤微生物群落的组成和功能潜力，从而抑制番茄枯萎病。

研究背景

农业集约化生产会降低微生物群落多样性、活性和对土传病害的抑制性，可能导致土壤有害微生物的不平衡增殖。通过提高土壤抗性或抗病能力能确保较高的农业生产力，然而，将利于土传病害发生的土壤转化为抑制性土壤，需要绕过土壤微生物的自然抗性。

熏蒸是一种抑制土传病害的方法，会对土壤微生物群落造成严重扰动。然而，病原菌有可能快速再侵染，因此熏蒸往往只有短暂的病害抑制作用。土壤有机改良剂是另一种广泛接受的管理策略，有机改良剂与生物防治剂的进一步互补是抑制土传病害的一种前景策略。但是，在高度侵染或多种病原菌侵染的土壤中，生物有机肥料抑制土传病害的效率较低，并且自然环境中土传病害相关的病原菌往往是多种同时出现，但大多数研究都集中在单一病原菌的探讨，这使得从实验条件到自然条件的转化成功率受限。此外，细菌和真菌病原菌的共同侵染可以改变疾病的结果，并有利于病原菌的发展。因此在解决抑制土传病害时，需要采取联合策略。

研究方法

测序平台：Illumina MiSeq PE250高通量测序

测序区域：微生物组细菌16S rRNA基因V4区；真菌内转录间隔区（ITS1）

试验设计：未熏蒸土壤+有机肥（CKOF）、未熏蒸土壤+生物有机肥（CKBF）、熏蒸土壤+有机肥（FOF）、熏蒸土壤+生物有机肥（FBF）。

研究结果

每个处理组番茄枯萎病发病率如图1所示，熏蒸处理FOF组与FBF组的番茄枯萎病发病率显著低于未熏蒸处理的CKOF组和CKBF组（p < 0.001）。

图1. 不同处理组番茄枯萎病的发病结果

利用qPCR检测土壤中青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的丰度。如图2所示，种植前青枯雷尔氏菌丰度在熏蒸处理和未熏蒸中没有显著差异，在收获期非根际土和根际土中熏蒸处理比未熏蒸处理显著降低。而尖孢镰刀菌的丰度在种植前和收获期的非根际土和根际土壤中熏蒸处理后均比未熏蒸处理显著降低。此外，移栽前和收获期间青枯雷尔氏菌丰度没有显著相关，而尖孢镰刀菌具有显著相关性。

图2. a 青枯雷尔氏菌和尖孢镰刀菌的丰度；b 两种病原菌丰度的相关性

本研究还进一步探究了土壤微生物丰度、丰富度、多样性以及发病率的关系。如图3所示，种植前和收获期间FOF组在非根际土壤中有更高的细菌丰富度和多样性，FOF组和FBF组在非根际土壤中真菌的丰度、丰富度和多样性均有减少，在根际土壤中，只有FBF组的真菌丰富度和多样性显着低于其他处理。相关性分析表明，番茄枯萎病发病率与根际真菌丰富度和多样性呈正相关，与细菌丰度、丰富度、多样性无显著相关。

图3. 土壤细菌和真菌在种植前和收获期的丰度、丰富度和多样性指数

另一方面，熏蒸和有机改良剂导致了微生物群落的变化。PCoA分析显示（图4a），非根际土与根际土在种植前和收获期的细菌群落组成沿第一组分（PCoA1）明显分离；而未熏蒸处理和熏蒸处理沿第二组分（PCoA2）明显分离。4个处理的真菌群落组成沿第一组分（PCoA1）明显分离；非根际土和根际土中沿第二组分（PCoA2）明显分离。未熏蒸处理组的细菌群落结构相较于熏蒸处理更相似（图4b）。熏蒸处理组中，细菌和真菌群落的更替较高，且与番茄枯萎病发病率显著相关（图4c）。

图4. 不同处理组间细菌和真菌的群落组成

通过只选择青枯雷尔氏菌或尖孢镰刀菌的SEMs分析显示（图5a~b），青枯雷尔氏菌相比于尖孢镰刀菌更容易直接产生病害，微生物细菌群落对两种病原菌产生主要影响。基于两种病原菌的SEMs分析显示（图5c），番茄枯萎病可能是由两种病原菌共同诱导的，但根际青枯雷尔氏菌对枯萎病发病率具有直接影响；根际细菌群落可以直接抑制青枯雷尔氏菌降低发病率，非根际细菌群落还可以通过抑制尖孢镰刀菌来间接抑制枯萎病的发病率，这表明可以通过联合作用减少病原菌从而降低枯萎病的发病率。

图5.枯萎病发病率的结构方程模型

根据上述结果，选择根际土壤和非根际土壤细菌群落与两种病原菌丰度进行相关性分析，结果如表1所示，3个非根际细菌与尖孢镰刀菌丰度呈显著负相关，6个根际细菌与青枯雷尔氏菌呈显著负相关。

表1 细菌OTUs与病原菌的相关性分析

总结

本研究通过未熏蒸与熏蒸加有机改良剂的番茄栽培土壤为研究对象，结果表明，熏蒸加有机改良剂是一种防治多种病原菌引起的番茄枯萎病的有效策略，其主要通过熏蒸直接抑制真菌病原菌，并通过施入有机改良剂改变细菌群落从而间接抑制真菌和细菌病原菌。