《中华肝脏病杂志》：间充质干细胞 治疗终末期肝病的研究进展

中华肝脏病杂志, 2021,29(7) : 618-621

作者：郑永园 朱姝 彭亮 高志良

DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20210610-00270

摘 要

终末期肝病指各种慢性肝脏损伤所致的肝病晚期阶段，原位肝移植是最主要的最终治疗方案，但目前肝移植仍受许多因素限制。间充质干细胞作为一类具有自我更新能力的多系祖细胞，具有多向分化、抗凋亡、抗炎、免疫抑制等功能。干细胞移植疗法作为终末期肝病的一种潜在治疗方法普遍受到关注。现就间充质干细胞治疗在终末期肝病中应用的研究进展进行综述。

肝脏是人体的重要器官，具有强大的解毒功能和再生能力。然而，病毒、酒精（乙醇）等因素慢性损伤肝细胞和内皮屏障，诱导炎症细胞浸润，导致活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）大量产生胶原和细胞外基质，从而形成肝纤维化，而晚期肝纤维化将进展为肝硬化^[1]。此外，当外源性损伤超过肝脏代偿能力时，凝血功能障碍、黄疸、腹水和肝性脑病等肝功能衰竭的表现随即出现，其进展迅速，治疗困难，总体预后很差。目前，终末期肝病的最终治疗方案是原位肝移植，在那些有幸接受肝移植的患者中，3、12、36个月的生存率分别为94%、88%和79%^[2]。原位肝移植受供体器官短缺、费用高、需要终生免疫抑制药物等因素限制，因此干细胞疗法作为一种潜在的治疗方法普遍受到关注。

干细胞可分为3类：胚胎干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。其中，MSCs较易获取，而且不受伦理问题的限制，因此最常用于细胞移植治疗^[3]。MSCs是一类具有自我更新能力的多系祖细胞，广泛分布于全身各处，可以从骨髓、脐带、月经液、胎盘、脂肪组织、牙髓、羊水等组织中分离纯化。MSCs的功能具有多效性，包括多向分化、抗凋亡、血管生成、促进组织修复、抗炎活性、生长因子产生、免疫抑制和神经保护特性。

1．MSCs治疗肝硬化：

（1）MSCs应用于肝硬化：目前，在多项动物实验中观察到MSCs的抗炎和抗纤维化作用^[4]。在应用MSCs治疗肝硬化的数项临床试验中，其安全性及有效性也得到验证。早在2004年，Sakaida等^[5]使用绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞，输注治疗四氯化碳（CCl₄）构建的肝纤维化小鼠模型。研究结果显示，接受MSCs移植的小鼠肝纤维化减轻，存活率显著提高。一项评价骨髓间充质干细胞（bone marrow-MSCs，BM-MSCs)治疗失代偿期肝硬化的疗效和安全性的Meta分析结果显示，输血后8、16、24、48周末白蛋白明显改善，终末期肝病模型评分、丙氨酸转氨酶、总胆红素和凝血酶原时间均有不同程度的改善，且无严重不良事件或并发症^[6]。（2）MSCs治疗肝硬化的机制进展：目前，越来越多的证据表明，MSCs改善肝纤维化及肝硬化的机制主要是分化为肝细胞样细胞、免疫调节及旁分泌效应。人脐带MSCs来源的外泌体（MSC-exosome，MSC-Ex）作为一种新兴治疗方法目前也备受关注。①肝细胞样细胞分化：MSCs在体外和体内都能分化为肝细胞样细胞（hepatocyte-like cells，HLCs），并能分泌营养因子，包括生长因子、细胞因子和趋化因子，促进受损肝脏的再生。Lin等^[7]及闫等^[8]通过构建硫代乙酰胺肝纤维化鼠模型并向其输注MSCs,通过检测人类肝细胞生物标志物（甲胎蛋白和细胞角蛋白18）和肝细胞特异性蛋白（白蛋白、TPH2和CYP3A4）以及干细胞基因（NANOG、OCT4和cKit）的表达水平，来评估MSCs向HLCs分化的潜能。Zhang等^[9]则通过尾静脉将MSCs移植到CCl₄诱导的肝纤维化大鼠体内，发现人肝标志物白蛋白、细胞角蛋白18、甲胎蛋白和CK19的表达在大鼠肝组织中逐渐增加，与MSCs移植时间的增加一致。MSCs不仅可以分化为有功能的肝细胞，并且可以改善肝脏转氨酶和合成酶功能，减轻肝脏组织病理学，从而逆转肝纤维化。②免疫调节：MSCs对于肝纤维化及肝硬化中固有免疫及适应性免疫的失衡都有极强的调节功能。研究结果表明，在固有免疫调节中MSCs移植可以激活表达MMP13的抗炎型M2巨噬细胞，抑制促炎型M1巨噬细胞，进一步减弱HSCs的激活，在改善CCl₄诱导的肝纤维化方面起到协同作用^[10]。而巨噬细胞和MSCs的联合可以诱导宿主中性粒细胞渗入肝纤维化区域，有助于肝纤维化的消退和促进再生^[11]。而在适应性免疫调节中，间充质干细胞在体外可以通过直接与T淋巴细胞相互作用或通过分泌可溶性因子[如前列腺素E2、IDO和转化生长因子（TGF）-β1]来抑制T淋巴细胞的增殖^[12]。此外，MSCs通过下调趋化因子（包括CCL1、CCL3、CCL8、CCL17和CCL22^[13]）的产生来限制T淋巴细胞向靶组织的迁移,从而减轻肝损伤。在CCl₄诱导的B淋巴细胞缺陷小鼠中观察到胶原沉积和纤维化明显减少^[14]，而间充质干细胞移植还能增加小鼠损伤肝脏中保护性产生白细胞介素（IL）-10和TGF-α的调节B细胞（regulatory B cells，Bregs）的浸润。③旁分泌效应：间充质干细胞分泌的细胞因子如IL-10、HGF、TGF-β等可抑制HSCs的增殖，减少胶原合成，促进肝修复。Zhang等^[15]通过体外实验，报道人UC-MSCs通过旁分泌抑制TGF-β1/Smads通路，抑制HSCs增殖、诱导HSCs凋亡，从而发挥抗纤维化作用。此外，MSCs还可表达多种可溶性因子，如一氧化氮（NO）、前列腺素E2、IDO、IL-6和人类白细胞抗原G，以调节各种免疫细胞的增殖和功能，诱导调节性T淋巴细胞生成^[16]。④MSC-Ex：人脐带间充质干细胞来源的外泌体（Huc-MSC-Ex）被认为是一种新型的无细胞治疗方法，其优点主要在于更低的免疫原性，更容易生产和储存及无致瘤风险。Jiang等^[17]通过将Huc-MSC-Ex注射到肝损伤及肝纤维化小鼠模型中，发现Huc-MSC-Ex可以抑制炎细胞浸润、肝细胞凋亡和小叶破坏，从而减轻了肝脏炎症和胶原沉积，而这些结果常与TGF-β1/Smad信号通路相关。

2．MSCs治疗肝衰竭：

（1）间充质干细胞应用于肝衰竭：同样的，已有多项动物实验及临床研究证实了MSCs治疗肝衰竭的安全性及有效性。在动物实验中，Li等^[18]利用暴发性肝衰竭猪模型，证实MSCs的即时门静脉内移植可以通过增殖和分化为肝细胞迅速参与肝再生。Kuo等^[19]发现MSCs和MSCs来源的肝细胞均能移植到受损的肝脏内，向功能肝细胞转化，挽救小鼠的肝功能衰竭。在临床试验中，Peng等^[20]研究发现自体BM-MSCs移植治疗乙型肝炎相关性慢性肝衰竭是安全的，且近期疗效良好。Lin等^[21]发现经外周静脉输注MSCs治疗慢加急性肝衰竭可以通过改善肝功能和降低严重感染的发生率来显著提高24周生存率。此外，一项纳入4个随机对照试验和6个非随机对照试验的Meta分析^[22]结果显示，接受MSCs移植治疗的慢加急性肝衰竭患者，第1、3、12个月血清总胆红素水平显著降低（P值均< 0.05），且终末期肝病模型评分相对于对照组差异有统计学意义（P = 0.008）。（2）间充质干细胞治疗肝衰竭的机制进展：当前研究者普遍认为，MSCs可以通过移植到受损的肝组织并分化为肝细胞，以及通过分泌营养和免疫调节因子、细胞外囊泡来促进肝再生。并且，在移植后，这些MSCs外分泌物通过及时抑制危及生命的细胞因子风暴和免疫细胞浸润，抑制肝细胞凋亡，逆转肝纤维化，支持肝细胞功能，促进血管生成，促进肝细胞增殖，有助于胆道修复，减轻炎性损伤。①肝细胞样细胞分化：人及啮齿类动物不同来源的间充质干细胞在体内外后均能分化为肝细胞。然而，移植的MSCs分化为HLCs的比例很低，Li等^[18]通过将MSCs输注到暴发性肝衰竭猪模型中，发现植入的人BMSCs的增殖和分化仅取代了受体猪肝中约4.5%的肝细胞。此外，尽管体外诱导后的HLCs与未分化的MSCs输注入肝衰竭动物模型中均可一定程度提高生存率，但何者对于肝衰竭的治疗价值更优，目前尚存在较多争议。②免疫调节：大量研究表明，MSCs对肝功能衰竭的治疗作用可能是基于其释放营养因子和免疫调节因子，并通过分泌可溶性因子和细胞间接触来调节免疫细胞。在暴发性肝衰竭中，MSCs的治疗作用主要是通过减少肝脏CD4⁺T淋巴细胞的浸润和活化、抑制辅助性T淋巴细胞1和诱导Treg细胞来抑制剧烈的炎症反应及随之带来的肝损伤^[15]。此外，MSCs通过抑制T淋巴细胞和树突状细胞，减少B淋巴细胞的活化和增殖，调节适应性和先天免疫反应，促进调节性T淋巴细胞的产生，抑制自然杀伤细胞的增殖和细胞毒性。③间充质干细胞来源的条件培养基（MSC-CM）：MSC-CM中含有多种可溶性生物活性因子，包括细胞因子、趋化因子、免疫调节分子和生长因子等，它们发挥免疫调节功能，抑制细胞死亡和纤维化，刺激血管形成，促进组织重塑，并在多种组织中募集其他细胞。MSC-CM能够将组织特异性祖细胞转化为体细胞，并通过旁分泌作用参与组织损伤修复。有研究表明，MSC-CM可部分改善急性肝功能衰竭，同时显著抑制肝纤维化、坏死性炎症、肝细胞凋亡和HSCs的激活，促进糖原的合成和储存以及肝再生。同时，MSC-CM减少了浸润的巨噬细胞，将CD4⁺T淋巴细胞转化为抗炎Tregs和Th2细胞，并促进了肝组织中HSCs的死亡^[23]。此外，有研究通过检测一系列炎症因子，发现MSC-CM治疗组干扰素-γ、IL-1β和IL-6水平显著低于对照组，而血清IL-10水平显著高于对照组，并且对MSC-CM进行蛋白质组学分析，发现抗炎因子中IL-10水平升高最为显著，而注射IL-10后信号转导和转录激活因子3磷酸化上调，AG490诱导的转录激活因子3抑制逆转了IL-10的治疗作用^[24]。④MSC-Ex：外泌体相对于MSCs，在输注入体内后不会受困在肺组织中，并趋化分布到受损的肝组织中。外泌体移植通过向肝组织迁移、抑制肝单个核细胞和下调凋亡蛋白caspase-3，显著抑制D-GalN/LPS诱导的急性肝功能衰竭小鼠肝细胞凋亡，提高存活率^[25]。MSCs还可以通过分泌外泌体诱导肝细胞向祖细胞卵圆形细胞转化，而这些祖细胞卵圆形细胞在肝脏再生中补充肝细胞。然而，MSC-Ex是否通过氧化应激在治疗肝功能衰竭中发挥作用还存在争议。

3．间充质干细胞应用于终末期肝病治疗方案的研究进展：

目前并没有标准的MSCs治疗方案。关于MSCs治疗肝硬化失代偿或肝功能衰竭的许多问题都需要进一步研究，包括最佳移植途径的选择、移植时间的确定、输注剂量、疗程及如何诱导更多的MSCs在体内定植、是否联合治疗等。在肝硬化患者的细胞输注中，有研究者认为肝内注射是较好的输注途径^[2]，而肝动脉输注更有利于细胞归巢。此外，联合肝素以保证血管的通畅性，可促使MSCs流入更多的靶组织^[26]。而另外一些研究则表明，与其他移植途径如外周静脉、肝动脉、肝内注射相比，经门静脉给药对肝功能衰竭有更好的治疗效果^[27]。此外，考虑到在肝功能衰竭时，当MSCs移植到剧变而不利的环境中，有可能难以适应新的环境，Xu等^[28]和Li等^[29]利用血浆置换联合UC-MSCs移植治疗乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭，前者结果显示UC-MSC+血浆置换组终末期肝病模型评分均显著降低（P < 0.05），且30、60、90 d病死率和不良结局发生率最低，后者结果显示24个月时UC-MSC+血浆置换组累积生存率显著高于单纯血浆置换组（54.5%比26.5%，经对数秩和检验P = 0.015）。同时，Jia等^[30]通过对513例接受间充质干细胞输注并符合肝功能衰竭和肝硬化诊断标准的患者进行为期3年的回顾性观察研究，发现延长疗程可提高UC-MSCs对终末期肝病，尤其是肝硬化患者的疗效。

目前，MSCs移植治疗终末期肝病的安全性及有效性已在多项动物实验和临床研究中得到证实，其发挥作用的机制主要是细胞分化与替代、免疫调节以恢复机体稳态、旁分泌多种细胞因子以协同减轻炎症反应、抑制肝细胞凋亡及促进肝细胞再生等。尽管目前MSCs治疗终末期肝病的方案未标准化，然而，治疗方案的各种细节都在当前研究下逐步被优化。相信在不远的将来，MSCs移植可以常规运用到终末期肝病的治疗中，以改善患者的生存质量及预后情况。

参考文献

[1]FriedmanSL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J]. Gastroenterology, 2008, 134(6): 1655-1669. DOI: 10.1053/j.gastro.2008.03.003.

[2]ZhangY, LiY, ZhangL, et al. Mesenchymal stem cells: potential application for the treatment of hepatic cirrhosis[J]. Stem Cell Res Ther, 2018, 9(1): 59. DOI: 10.1186/s13287-018-0814-4.