非小细胞肺癌常见基因突变检测规范
编者按：肺癌是当今世界严重危害人类健康的恶性肿瘤，分子生物学进展大大改变了晚期NSCLC的治疗格局。肺癌的靶向治疗离不开肺癌的分子检测，分子检测涉及到各个方面，任何一个因素都可能影响分子检测结果准确性。为了规范肺癌的分子检测，AZ联合国内相关专家对肺癌分子检测的样本要求、检测平台、检测治疗与规范和检测观念进行全面阐述。本期91360智慧病理网邀请山东大学齐鲁医院韩博教授以EGFR基因突变为例浅谈非小细胞肺癌中常见的基因突变改变、初治/耐药患者如何进行基因突变检测以及常见基因突变的检测策略进行相关介绍。
韩博 教授
山东大学教授，博士生导师。齐鲁医院病理科副主任。
全国基础医学形态学实验室主任联席会副会长，中华医学会病理学分会泌尿及男生殖学组副组长、中华医学会病理学分会分子病理组委员、中国病理学工作者委员会常委，吴阶平医学基金会病理学部常委，山东省医学会病理学分会副主委暨分子病理学组组长，山东省医师协会病理科医师分会副主委，山东大学学报（医学版）常务编委等职。
2016年获中国杰出青年病理医师荣誉称号。获山东省科技进步奖二等奖1项，医学科技创新成果奖及省高等学校科学技术成果奖二等奖各1项。2018年获山东省优秀医师称号。
从事恶性肿瘤的发生和演进的机理以及临床病理组织学的研究，擅长前列腺疾病的病理诊断。2010年至今，主持国家自然科学基金项目7项。已发表SCI文章70余篇，合计影响因子大于300；国家自然基金及通讯评审专家。
非小细胞肺癌常见基因突变检测规范
1 非小细胞肺癌常见基因突变概述
肺癌是我国发病数与死亡数最高的恶性肿瘤，其中80%以上为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]。但随着分子病理诊断技术及靶向药物研发不断进步，NSCLC靶向治疗也获得了长足进展，NSCLC患者术后靶向治疗的客观缓解率及无进展生存时间显著延长，生活质量也稳步提高。准确、可靠的基因检测方法对筛选适合靶向用药的患者及NSCLC临床诊疗具有积极意义。
随着分子病理检测在国内推广，大数据显示我国NSCLC患者的分子病理特征与欧美人群有所区别[2]。其中，肺腺癌常见的变异基因包括表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR，45%-55%）、KRAS（8%-10%）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK，5%-10%）。上述基因变异中，EGFR第18-21号外显子点突变、缺失、插入已成为国内外NSCLC治疗指南推荐的必检突变。EGFR在NSCLC患者肿瘤组织中具有高频突变，针对其突变的吉非替尼等酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors，TKIs）已获批上市并在临床治疗中取得良好预后。但不同EGFR突变对临床预后、靶向用药、耐药特征具有不同意义，因此，检测规范对于EGFR突变的分子病理检测尤为重要。
2 EGFR基因检测
EGFR作为表皮生长因子家族的重要成员之一，与细胞生长发育密切相关。在NSCLC中，其基因突变如19号外显子缺失及L858R突变会导致EGFR持续激活，促进肿瘤恶性生长[3]。因此，检出19号外显子缺失及L858R突变的患者推荐应用TKI，如一代TKI吉非替尼、厄洛替尼；二代TKI阿法替尼等治疗，自2005年吉非替尼在国内获批以来，TKIs已证实对具有上述EGFR突变的NSCLC患者具有良好疗效，在无进展生存、有效率方面，与传统化疗相比均有明显延长，同时生存质量及耐受性较好。但上述TKIs使用后一段时间内，约50%的患者肿瘤EGFR基因会出现继发性T790M突变，该突变会导致患者对TKIs耐药，后继治疗效果不佳。因此，针对T790M突变，2017年上市的三代TKI奥希替尼能够针对EGFR继发性T790M突变的NSCLC患者具有靶向抑制作用，发挥更好疗效。而近年来报道显示，奥希替尼耐药后，仍然有15%的患者进入C797S的耐药进程，有望继续使用新的四代EGFR靶向药物。因此，针对NSCLC患者开展EGFR分子病理检测，精准获得EGFR突变类型，对指导TKIs用药具有非常重要的指导意义。
3 非小细胞肺癌常见基因突变的检测策略
针对上述NSCLC中的分子基因改变，分子病理常见的检测方法包括免疫组织化学方法、荧光原位杂交技术、qRT-PCR技术、数字PCR技术、二代测序技术等。
针对初诊患者，由于NSCLC患者确诊时往往有组织样本，在样本充足的情况下，初次基因检测应推荐ARMS-PCR或NGS方法常规检测EGFR、ALK、ROS1等多基因[1]。而靶向治疗耐药后一般需再次进行基因检测以确定后续治疗方案，但耐药突变往往比较复杂，需要同时兼顾检测广度及灵敏度。以一二代EGFR TKI耐药患者检测为例，患者应优先检测T790M，但也有可能由于MET扩增、HER2扩增、PIK3CA突变、KRAS等其它突变导致，并且大部分患者无法取组织只能送检ctDNA含量极低的血液样本，针对血液送检的耐药患者，可选择NGS ddPCR检测方案。NGS可同时检测数十种甚至上百种耐药相关基因，检测广度高，但其局限性是检测下限一般仅能检测0.1%以上的突变，且阴性结果不能排除MET扩增，如血液检测漏检导致假阴性将影响患者后续治疗方案的制定。而数字PCR特点是高灵敏度，可以检测血液中低至0.03~0.1%的T790M突变，并且可同时检测MET扩增（定点扩增及多倍体扩增），其局限性是仅能检测已知突变，无法同时检测所有耐药相关基因。一二代EGFR TKI耐药患者检测血液标本可选择NGS ddPCR检测方案，同时兼顾低丰度的T790M突变/MET扩增和其他多种耐药突变。因此，针对靶向治疗耐药的患者，应用两种或多种检测技术共同诊断，可有助于结果互补及验证，更好地发现耐药突变，为患者尽可能寻找有效的治疗方案。
这些检测方法均具有不同的优缺点，同时检测方案的制定与肿瘤基因突变类型、基因突变丰度、样本质量、样本类型、实验室条件等多种因素有关。根据《指南》推荐，NSCLC患者样本选择上因首选考虑组织样本或细胞学标本。当肿瘤组织及细胞学标本不可及时，可选择血液、脑脊液标本用于基因检测，同样可为靶向用药提供重要信息，但由于ctDNA含量极低，需选择更为灵敏的检测平台[1]。另外，检测流程上应严格按照实验室SOP要求，在相关检测指南、共识的指导下进行，只有规范严格的基因检测流程，才能行稳致远，更好地指导临床精准治疗，带给患者更多获益。
参考文献
1，非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）。中华病理学杂志，2021, 50(4):323-332。
2，中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组. 中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识. 中华病理学杂志, 2011, 40 (10):700-702.
3，Mitsudomi T, Morita S, Yatabe Y, et al. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harboring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomized phase 3 trial[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(2): 121-128. DOI: 10.1016/S1470-2045(09)70364-X.
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